2019-08-28
什么是动物石蜡切片
动物石蜡切片是我们进行人、动物疾病诊断、病理学研究、教学的一种重要方法。动物石蜡切片制作过程中取材、固定、脱水、透明、浸蜡、切片、展片、染色等步骤。随着科学研究的进步，目前在人、动物传染病的诊断方面经常采用准确、快速的PCR、Elisa等分子生物学方法。但是，PCR、Elisa等方法要求操作精细、准确，由于操作不当会出现假阳性或假阴性；对于肿瘤等内科病也无法诊断。石蜡切片可以直观的观察到组织细胞的病理变化，是一种准确、低廉的诊断疾病方法，在疾病诊断、病理学研究、教学等方面广泛应用。
实验原理
采用光学显微镜研究一般生物体的内部结构，在自然状态下是无法观察清楚的，多数动、植物材料都必须经过某种处理，将组织分离成单个细胞或薄片，光线才能通过细胞。为了适应这个需要，就产生了光学显微镜制片技术。
光学显微镜的制片技术方法可分为两大类：一类是非切片法，另一类是切片法。
非切片法，是用物理或化学的方法，使细胞彼此分离，如有分离法、涂布法、压碎法等。非切片法的操作比较简单，能保侍细胞的完整，但是细胞之间的正常位置往往被更动，无法反映细胞之间的正常联系。它可以与切片法配合使用，各取其长处。
切片法，是利用锐利的刃具将组织切成极薄的片层，材料须经过一系列特殊的处理，如固定、脱水、包埋、切片、染色等，过程十分繁复。在制作过程中，还要经过一系列的物理和化学的处理，这些处理方法可根据各种不同材料的性质要求进行合理选择。切片法虽然工序繁琐，技术复杂，但是，它能保持细胞间的正常的相互关系，能较好和较长时间地保留细胞的原貌，所以仍然是光学显微镜的主要制片方法。
优点：石蜡能切出极薄的蜡片（2～10μm）；切片时能连成蜡带，便于制作连续切片；操作较容易，组织块可以包埋在石蜡中长期保存。
缺点：石蜡切片的制作过程较长，步骤很多，一步不慎往往导致前功尽弃，而且这些处理引起组织块或多或少地收缩，切片时受湿度影响比较大，这些不足之处必须在制片过程中认真对待，尽量减小它的不良影响。
后续研究背景与目的
从福尔马林固定、石蜡包埋组织内提取DNA一直以来都是一项困扰着众多研究人员的难题。
甲醛作为常用固定液福尔马林的一个重要成分，可以引起核酸大分子之间以及核酸与蛋白质之间的广泛交联，这一反应将会导致从组织内提取DNA十分困难。不仅如此，如果固定所用的固定液不是缓冲型中性福尔马林溶液，还将出现甲醛被氧化生成甲酸后，固定液的PH值大幅降低，有时甚至会出现PH小于1的情况，这种酸性的环境将会导致DNA链的断裂。
这些作用都导致无法利用PCR扩增技术得到满意的DNA片段长度和含量，从而严重影响了分子生物学研究。尽管从福尔马林固定石蜡包埋组织提取DNA十分困难，但却不能忽视这些组织可能为基因遗传学等研究提供的信息。在世界各地的医院及病理研究所都储存着大量的固定组织，它们常是唯一的致病相关基因研究重要的研究对象。正是因为如此，越来越多的学者开始研究如何从固定组织提取高质量DNA，并有一系列的相关论文逐渐发表。
不容乐观的是，虽然相关性文章在不断增多，但是这些文章所提及的方法，能够达提取到高质量DNA的并不多。
首先，因为研究目的不同，对目的基因要求不同，很难用同一的标准来判定提取DNA的质量；
其次，虽然有些方法可以保证提取出的DNA含量，但是因为这些组织内的DNA多由于固定的原因而降解成较小的DNA片段，尽管含量可观，无法保证片段长度，这种方法仍难以推广。
其实，影响固定组织内DNA质量的因素有很多，大体可以分为：
1．固定前因素，这就包括了组织的类型和大小，固定前它的腐败程度等等；
2．固定因素，包括了选取何种固定液，固定液的PH值，温度以及固定时间的长短等；
3．固定后因素，例如固定后储存时间的长短和储存温度的高低等。
面对上述影响因素，想要找到一种理想的提取方法需要进一步研究，并结合考虑样材情况。因此不能对已提出方法的效果妄下判断，这些方法可以减少某一影响因素的影响，却不能同时解决所有问题。例如，在关于组织消化时间的问题上，有的学者就提出加入消化酶后，尽可能延长孵育时间是十分有利的；但也有的学者提出消化时间不宜超过3个小时。这些看似矛盾的结论，其实是基于不同的因素考虑。在当前国内外发表的文章中，所提及的提取办法有的是较以往有较大不同的，有的仅是在特定步骤稍作改动的。
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图1 DNA电泳图
表1 浓度表 （与上表对应）
表2 各处理比较
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石蜡切片> 5片
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