2019-12-17
引言：单细胞转录组测序(Single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq)是在单个细胞水平对 mRNA 进行高通量测序的一项新技术，能够有效解决组织样本无法破解的细胞异质性难题，在免疫、肿瘤研究领域可发挥重要作用。近期，Cell子刊Immunity在线刊登了美国匹斯堡大学Stephen H. Thorne研究团队的最新研究成果，该团队利用scRNA-Seq等技术手段发现一种激素——瘦素，可与溶瘤病毒协同作用，对肿瘤产生较好的疗效。更令人兴奋的是，瘦素+溶瘤病毒的共同作用可激发机体对肿瘤的免疫记忆，为癌症免疫疗法开辟了新的途径。
文章题目：Oncolytic Viruses Engineered to Enforce Leptin Expression Reprogram Tumor-Infiltrating T Cell Metabolism and Promote Tumor Clearance
发表期刊：Immunity
发表时间：2019年
影响因子：21.5
技术手段：单细胞转录组测序scRNA-Seq、流式细胞术等
1、溶瘤病毒是一类能够有效感染并消灭癌细胞的病毒。 2015年美国食品药品管理局FDA已批准了一种单纯疱疹病毒T-VEC用以治疗黑色素瘤。遗憾的是，大多数溶瘤病毒疗法单独使用时不会产生持久反应，肿瘤细胞将迅速产生抗药性。
2、目前认为，T细胞的代谢不足是限制各类癌症免疫疗效的关键：癌细胞新陈代谢紊乱，耗尽了基本营养物质，使得肿瘤浸润淋巴T细胞在缺乏氧气和养分的肿瘤微环境中无法发挥功能。而有研究表明，T细胞的代谢重编程或肿瘤微环境的调节可以增强抗肿瘤免疫反应。
3、瘦素（leptin）是一种典型的脂肪因子，具有促进葡萄糖及脂肪氧化、线粒体生物合成等功能。有研究表明T细胞表达瘦素受体，且表达水平与炎症反应有关。目前瘦素的代谢机制相关研究主要基于肥胖背景展开，未有针对肿瘤的研究。
基于以上背景，本研究利用单细胞转录组测序等手段，探讨了溶瘤病毒诱导的免疫反应机制、瘦素对T细胞代谢重编程的激活，以及瘦素+溶瘤病毒协同作用对肿瘤的治疗效果。
1、溶瘤病毒（VV）可重塑肿瘤免疫微环境
在小鼠皮下注射黑色素瘤细胞系CL24，当肿瘤生长至直径4mm时，在瘤内注射单剂量的溶瘤牛痘病毒（Vaccinia virus，VV），对照组注射PBS。结果显示，VV处理组的小鼠肿瘤生长受到抑制，但无实质性效果（图1A）。随后对该处理下肿瘤组织中的免疫细胞进行单细胞转录组测序。无监督聚类数据分析显示，与对照组相比，VV组出现了CD8+T细胞、自然杀伤（NK）细胞和单核细胞的流入，而MDSCs和肿瘤相关巨噬细胞比例下降（图1B，C）。以上结果表明，溶瘤牛痘病毒（VV）可诱导肿瘤免疫微环境的重塑，即引起免疫细胞（以T细胞为主）对肿瘤组织的浸润，但效果不佳，无法完全阻止肿瘤的生长。、
图1 溶瘤牛痘病毒具有强大的免疫刺激活性
2、溶瘤病毒（VV）对T细胞的促进效应受制于代谢缺陷
用流式细胞术分析经VV处理的小鼠肿瘤浸润淋巴细胞，证实新免疫细胞的流入以CD8+T细胞为主（图2A）；进一步分析这些CD8+T细胞的PD1、Tim-3表达量及线粒体数量可发现（图2B-D），虽然“新”的T细胞未完全耗竭，但仍处于缺氧和代谢不足的状态。该结果表明，溶瘤病毒虽可诱导T细胞的流入，但对其在肿瘤细胞中遇到的代谢功能障碍无能为力。
图2 肿瘤浸润淋巴细胞分析显示，VV处理的T细胞存在代谢缺陷
3、瘦素（leptin）可激活T细胞
体外实验证实，1.0 nM的瘦素（leptin）处理离体培养的T细胞可使其线粒体的基础耗氧率和备用呼吸能力提高（图3A）；此外，免疫印迹实验显示，经瘦素处理的T细胞中MAPK和转录因子ATF-2表达量显著增加，而这两种蛋白对线粒体的生理功能有重要意义（图3B）。体内实验证明，相较于正常淋巴细胞，肿瘤浸润淋巴细胞中含有更多的瘦素受体，且活化的T细胞中瘦素受体表达量显著提高（图3C，D）。综上，离体条件下瘦素可通过代谢重编程激活T细胞，且肿瘤浸润淋巴细胞上具备该激素的受体。
图3 瘦素受体在肿瘤浸润T细胞中上调表达，且瘦素能激活代谢重编程
4、提高肿瘤微环境中局部瘦素蛋白浓度可增强抗肿瘤免疫
通过基因编辑设计可表达瘦素的黑色素瘤细胞CL24-leptin，对照为仅导入空质粒的黑色素瘤细胞CL24-hygro。对小鼠皮下注射该细胞后观察肿瘤生长情况发现，相较于CL24-hygro处理，CL24-leptin处理的肿瘤生长速度明显减慢（图4A），且小鼠寿命显著延长（图4B）。这表明瘦素可能会刺激宿主产生免疫。随后利用T细胞瘦素受体缺失的小鼠进行瘦素过表达实验，发现其肿瘤生长不受免疫系统控制（图4C）。综上可知，肿瘤微环境中瘦素的局部升高可直接作用于T细胞，从而控制肿瘤生长。
图4 瘦素在肿瘤细胞中的表达可激活免疫反应
5、瘦素可在代谢层面增强肿瘤浸润淋巴细胞的功能
利用CD8+T细胞浸润过表达瘦素的肿瘤，并对肿瘤浸润淋巴细胞进行研究发现：该细胞原位增殖更明显（图5B），线粒体质量增加（图5C），且细胞干扰素-γ (IFN-γ)和肿瘤坏死因子α (TNF-α)表达量升高（图5A）。说明瘦素不仅促进了T细胞的浸润，更改善了它的代谢功能，且其对T细胞的效应具有多功效性和增值性。
图5 瘦素从代谢水平改善肿瘤微环境中T细胞的功能
6、表达瘦素的溶瘤病毒（VV-leptin）可介导较强的抗肿瘤反应
通过基因编辑设计出可表达瘦素的溶瘤牛痘病毒（VV-leptin），选择两种对免疫治疗耐药性强的癌细胞：黑色素瘤细胞（CL24）和胰腺癌细胞（Panc02）构建肿瘤小鼠模型，分别进行VV-leptin、VV和PBS处理（图6）。结果表明，仅注射溶瘤病毒未能有效控制肿瘤生长，而瘦素-溶瘤病毒处理下肿瘤生长明显受到抑制，为小鼠带来了显著的生存优势。
图6 瘦素+溶瘤病毒通过代谢重编程促进抗肿瘤免疫反应
7、 表达瘦素的溶瘤病毒（VV-leptin）可诱导免疫记忆
进一步分离VV-leptin、VV和PBS处理后肿瘤组织中的T细胞，对其进行单细胞转录组测序，以定义其细胞群。无监督聚类证实，VV-leptin处理组的肿瘤组织中T细胞数目并不显著高于VV和PBS处理，但其表形发生了变化（图7A），属于“效应记忆”和“记忆”的细胞类型增加（图7B）。生物活体实验结果更令人兴奋：对VV-leptin处理后治愈的11只荷瘤小鼠再次接种肿瘤，其中8只小鼠完全抵抗了肿瘤的生长，剩余3只小鼠的肿瘤生长速度也明显变慢（图7C）。说明经过VV-leptin治疗后小鼠获得了免疫记忆，可以抵御同种肿瘤细胞的再次侵染。
图7 瘦素在溶瘤病毒诱导的免疫浸润中促进记忆反应
1、单细胞测序揭示溶瘤病毒处理的肿瘤中发生免疫重建。
2、脂肪因子瘦素在体内外均可增强T细胞的代谢功能。
3、溶瘤病毒+瘦素可增强抗肿瘤免疫，更重要的是，二者结合可诱导机体产生免疫记忆。
原文索引：Dayana B. Rivadeneira et al. Oncolytic Viruses Engineered to Enforce Leptin Expression Reprogram Tumor-Infiltrating T Cell Metabolism and Promote Tumor Clearance. Immunity, 2019, doi:10.1016/j.immuni.2019.07.003.
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.immuni.2019.07.003
