2020-02-24
2019年12月初，在我国武汉地区流行一种以发热、肺部感染为症状的传染性疾病，继而肆虐全国，全国各地甚至国外相继报道出现这种疫情。这种疾病的症状不同于典型肺炎，且对常规抗菌治疗无效，也未鉴定出已知的引起肺炎的细菌或病毒等病原体。2020年1月，各类专家通过高通量测序证实本次武汉流行的不明原因肺炎的病原体为一种以前未知的β属冠状病毒（见图1）。
图1
2019-nCoV基因组序列已通过测序解析完成，结果显示基因组含有约29000个碱基，有12个蛋白编码区/开放读码框（ORF）（见图2），包括1ab、S、3、E、M、7、8、9、10b、N、13、14；与蝙蝠SARS样冠状病毒bat-SL-CoVZC45、bat-SL-CoVZXC21和人SARS冠状病毒SARS-CoV 3种冠状病毒相应蛋白质的长度非常相近；其中ORF 1ab为RNA依赖的RNA聚合酶基因（RdRp）所在区域，编码RNA聚合酶，负责病毒核酸复制；S区编码棘突蛋白，与病毒感染能力相关，通过与细胞表面血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）受体结合进入宿主细胞；E区编码囊膜蛋白，负责病毒包膜及病毒颗粒的形成；M区编码膜蛋白；N区编码核壳蛋白，与病毒基因组宿主RNA互相识别。由于2019-nCoV的RdRp基因在进化树上与SARS-CoV的RdRp基因显著不同，故被列为一种新的β属冠状病毒。因而，RdRp基因也成为鉴定2019-nCoV核酸的一个重要标志物。
图2
中国军网北京1月29日电（特约记者庄颖娜 、记者邵龙飞），1月28日由中国人民解放军军事科学院军事医学研究院与圣湘生物科技有限公司共同研制的新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测试剂盒（RT-PCR荧光探针法）通过国家药品监督管理局应急审批，获得医疗器械注册证书。该检测试剂基于新发布的新型冠状病毒（2019-nCoV）基因序列信息，融合荧光定量探针检测的原理，针对其特异性基因序列进行了双靶标基因设计。主要针对新型冠状病毒基因组中开放读码框1ab（open reading frame 1ab ， ORF1ab ） 和 核 壳 蛋 白 （ nucleocapsid protein，N）。N基因区域的引物和特异性探针。
靶标一（ORF1ab）:
正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA
荧光探针（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'
靶标二（N）:
正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
荧光探针（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'
核酸提取和实时荧光RT-PCR反应体系及反应条件参考相关厂家试剂盒说明。
结果判断 阴性:无Ct值或Ct≥40。 阳性：Ct值<37，可报告为阳性。
灰度区：Ct值在37-40之间，建议重复实验，若重做结果Ct值<40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性,否则为阴性。在实验室要确认一个病例为阳性，满足以下条件： 同一份标本中新型冠状病毒2个靶标（ORF1ab、N）特异性实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性。
为什么探针荧光RT-PCR法，很快成为该病毒高效、便捷的检测方法呢？
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一、基本原理
1、荧光定量PCR原理：荧光定量PCR技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程。随着PCR 反应的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，结合相应的软件对产物进行分析，可以得到荧光扩增曲线，计算待测样品初始模版的量。实时荧光定量PCR技术是一次由定性技术向定量技术的飞跃，运用该项技术，可以对DNA、RNA样品进行相对定量、绝对定量和定性分析。
图3
2、TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5`末端，而淬灭剂则在3`末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。
图4
二、主要特点
与染料法相比具有更低的背景信号，更高的灵敏度，可以检测低于10个分子的模板，更高的特异性，结果也更准确。同时也具有染料法的操作简单，不影响酶促反应，耗时短（新冠肺炎病毒检测需5-6h就可以出结果，快的测序也要48h）等优点。
三、范围广
探针在流式细胞技术、免疫学、实时定量PCR技术、细胞调亡检测及肿瘤细胞的识别中能应用。
为什么荧光定量探针法在医学领域能稳稳的站得住脚呢，向上看！向上看！向上看！
但是在方便的同时，前期的研发，调试等繁琐的工作，是由奋战在前的前辈们经过日日夜夜劳动得到的成果，向他们致敬！
为了向科研人员致敬，接下来派森诺将接替前期繁琐的工作，给科研人员更多的时间去思考。
派森诺新型TaqMan-MGB探针服务
新型TaqMan-MGB探针技术可以进行基因定量分析，亦可分析基因突变（SNP）。TaqMan-MGB探针与普通TaqMan荧光探针相比具有更短的序列和更高的序列特异性，常被用于SNP分型的研究中。
派森诺的优势
派森诺有自主的合成平台一次合成及二次合成速度快
一周可以拿到引物、探针及各个环节实验条件和参数
减少您摸索的时间及多次摸索产生的花费
资深博士跟踪为您提供有价值的建议
派森诺的服务内容
内容 | 荧光定量引物、探针 | TaqMan-MGB探针（多用于SNP、miRNA） |
服务周期 | 7个工作日 | 3～4周 |
公司交付结果 | 引物、探针成品 | 引物、探针成品 |
质粒标准品 | 质粒标准品 | |
实验条件及电泳图 | 实验条件及电泳图 | |
调试后的荧光定量结果 | 调试后的荧光定量结果 | |
客户提供信息 | 基因名称及登录号 | 基因名称 |
基因种属 | 基因种属 | |
实验的目的及要求 | 实验的目的及要求 | |
TaqMan探针的标记种类 | 默认为TaqMan-MGB探针 |
派森诺的要求
客户提供不少于5ug的DNA or cDNA，作为调试模板。若不提供模板，公司进行调试，但不受理售后问题；若客户提供模板，调试后，不出结果或者CT值很大，我们会告知，若不再继续，那么实验终止；若选择用我们的模板进行调试，引物调试正常后，发货，不受理售后问题。
派森诺服务宗旨
把繁琐的实验交给我们，还你清晰透明的实验方案。
