2020-06-01
研究菌群多样性组成谱主要是以细菌/古菌 16S rRNA基因可变区、真菌 18S rRNA 基因可变区或真菌 ITS（Internal transcribed spacer）内转录间隔区等微生物特征序列（Signature sequence）为靶点，通过检测序列的变异和数量，反映菌群中各类微生物物种的身份和丰度，从而快速解码菌群物种分布特征，阐明样本间多样性和组成差异，进而发现差异相关物种。菌群的物种分布与所取得的样本有很大的相关性，所以样本的收集和处理环节对后续的结果至关重要，今天主要来聊下针对不同的样本有什么样不同的取样策略。
取样前要做哪些准备呢？
不同的样本取样时的准备会有差异，但是大部分都会涉及到如下：
1. 取样用品准备：由于所取样本不同，需要准备的取样器材不同，包括但不局限于经过灭菌的采血管、镊子、EP管、铲子等。
2. 取样前对样本的处理：若是固体整块的样本，建议用无菌器材切取有代表性的部分；若是液体样本，建议混匀后取样；若是粉末样本，建议边取边混等，确保样本的均匀性。
3. 取样前或取样后：在盛有样本的容器上做好标记，密封，适当温度保存。
土壤污泥类样本要怎么取样？
1. 根据研究目的确定采样范围，去除表面浮土，挖取地下5~20cm的土层。
2. 去除可见杂质，土壤过2mm筛网，每个样品从3个及以上采样点采集并混合而成，每1～5g分为一份袋装保存；或取200-500mg分装到2ml灭菌EP管中，足够满足一次实验需求，同时根据实验要求做好备份；避免运输过程中样品出现散漏等异常情况，置于低温保存。
3. 污泥样品在取样时，需直接混匀；沙土类微生物含量相对少，可以多备些样本，每5～10g为一份，袋装保存。
粪便类样本要怎么取样？
一、人类粪便
方法一：
1. 准备好便盆或粪便容器，洗手，带上手套收集新鲜的粪便样本，粪便样本中尽量无尿液。
2. 用无菌牙签或粪便取样器截取样品中段里部（粪便表层含有肠粘膜脱落细胞），外部容易污染，且接触空气后，部分细菌 DNA 开始降解。
3. 用灭菌离心管每管称取约0.2g左右粪便样本，每个样本取多管备份。
4. 分装好后，若当天提取DNA，可以先放4°C，长期存放需先迅速放入液氮中，之后立即放入-80°C保存。
方法二：（推荐）推荐使用等分析管技术
1. 将粪便直接排便到无菌容器中，如果有条件，可当场进行后续操作，如果没条件可将样本在低温下运输，收集后48小时运输到实验室操作。
2. 使用吸管在粪便中反复插入，直到用均匀的混合物和最小的气穴填充吸管；若在粪便样品太软或水分太多而无法填充吸管的情况下，使用无菌1ml注射器。吸管或者注射器有刻度，每次能确保取样量相同。
提示：取样最好在生物安全柜中进行。
二、小鼠粪便
分别收取目的小鼠的粪便，立即进行收取，尽量不要暴露在空气中太长时间，避免污染和降解。
水体怎么取样？
1. 根据研究目的确定采样深度和范围。
2. 采集好的水样需要通过滤膜进行过滤，可以根据水样的浑浊程度选择相应孔径的滤膜（清亮水样：可选择小孔径的滤膜，一般选0.22μm或0.45μm的滤膜，过滤水样体积大 于10L；浑浊水样：过滤前静置分离悬浮颗粒，也可以用大孔径的滤膜预过滤一遍，再用小孔径的滤膜进行过滤）。
3. 根据实验需要做好备份，同时将滤膜-80℃保存备用。
食品类样本怎么取样？
1. 小包装类样品尽可能取原包装，直到实验前不要开封，以防污染。
2. 固体类样品最好在不同部位采样，一起放入灭菌离心管或者其他无菌容器保存。
3. 液体类样品，取样前尽量摇动混匀，放入15ml灭菌离心管，不要超过体积的四分之三，防止曝管。
研究表面微生物的应该怎么取样？
1. 对于形状较小的物体，直接将其放入无菌的容器中，加入PBS进行冲洗，振荡使微生物脱落到PBS中；取液体放入灭菌离心管，-80℃保存备用。
2. 对于大的物体建议采用无菌棉签沾取无菌水擦拭物体表面取样，擦拭时在表面缓慢旋转涂抹擦拭几次，建议多擦拭几个拭子；或用无菌手术刀片轻轻刮取物体表面取样，将棉签或刮取物放入灭菌离心管，-80℃保存备用。
研究植物内生菌应该怎么取样？
1. 用流水冲洗植物根样本表面并摘掉小侧根，粘根土壤颗粒等以后对样本进行化学消毒（95%的次氯酸钠最少2min）。
2. 把样本放入含有无菌玻璃珠的无菌水中剧烈摇晃，物理去除表面细菌。
3. 取出样本后用手术刀片划开根部表面，切取内部组织。
4. 把切取后的组织放入含有无菌玻璃珠的9%的生理盐水中振荡，在30℃的条件下振荡4h以分离内生菌。
5. 用5μm滤膜过滤，15000rpm，4℃离心收集沉淀，长期存放需先迅速放入 液氮中，之后立即放入-80°C保存。
血液样本怎么取样？
1. 采集新鲜血液于含有EDTA的抗凝管中；颠倒数次混匀血液和EDTA。
2. 常温3000rpm离心15min，弃上层血浆。
3. 下层血细胞分装到EP管内，并标记好样品名称和日期保存在-20℃冰箱。
环境样本怎么取样？
1．自然沉降法：利用空气微生物颗粒的重力作用，在一定时间内，让所处区域的微生物颗粒逐步沉降到收集器皿（不推荐）。
2．使用各类抽气装置，针对实验目的空气微颗粒，用不同孔径大小的无菌滤膜筛选目的颗粒，多次收集备用；将含颗粒过滤膜装入无菌铝箔内，密封在-80℃长期保存。
口腔样本怎么取样？
一、唾液样本
1. 取样前30分钟，无进食、吸烟等动作。
2. 采样之前要用双手按摩脸颊两侧，尽可能的用舌头多刮几次上下颚，同时也可以用牙齿稍微的刮一下舌头，保证脱落细胞的数量，使唾液流入唾液采集管中。
二、口腔内组织样本
1. 口腔内组织的取样建议用样本采集拭子，确保在所要取样部分反复擦拭最少10秒。
2. 采集后的拭子放入无菌管低温保存。
呼吸道样本怎么取样？
一、上呼吸道
建议鼻拭子或者咽拭子，放保存液中保存。
二、下呼吸道
推荐支气管镜取样：内窥镜伸到气道中的“楔子”，徐徐滴入生理盐水，再抽吸出来并捕获。保存在灭菌离心管-80℃备用。
三、痰液
尽量少带唾液，获得痰液后可以加入二硫苏糖醇来稀释样本。
肠道内容物怎么取样？
1. 在实验对象死亡后，用无菌解剖刀，在无菌状态下取出整个肠道，切取所需肠段的内容物（条件允许的话，可在无菌操作台进行）。
2. 用无菌手术刀挖取内容物，立即放在冰上进行分装并标记。
3. 用灭菌离心管分装，单个样本取样量：0.2-0.5g/管。为保证实验顺利进行，每个样本取多管备份，在采样允许的情况下，尽量多采集样品。
