2020-06-11
也许你很难想象一片叶子、一块肌肉、一管血液都经历了什么，最后以核酸的形式呈现。核酸的提取是所有分子生物学研究的基础，核酸提取的质量、浓度的多少对于下游分子生物学实验的成败起着关键的作用，今天我们就说一说关于DNA提取的那些事儿。
一. DNA提取原则 1、保证DNA分子的完整性 2、排除有机溶剂与金属离子的干扰 3、排除蛋白质、多糖、多酚、脂类的污染 4、获得高纯度的核酸 5、方法操作简便，稳定性强 二. DNA有哪些 染色体DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA、质粒DNA、病毒/噬菌体DNA等。 三. 样本的收集保存 注：详细操作可参见《派森诺样品制备及质量要求》文件，可向当地销售或技术支持索取。 四. DNA提取原理及方法 目前提取DNA的方法繁多，如CTAB法、SDS法、各种试剂盒等，但原理大致相同，主要是裂解和纯化两大步骤。首先对样品破壁裂解，采用机械力、化学试剂、酶等方法将DNA释放出来，随后去除蛋白质、糖、酚、金属离子等杂质，再用无水乙醇、异丙醇沉淀或载体吸附DNA，之后洗涤溶解即可得到核酸。 虽然原理相似，但不同提取方法使用的试剂有很大差别，下面列举出在提取过程中，常用试剂的作用及原理： 1、裂解相关试剂 （1）CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）:一种阳离子表面活性剂，在高盐溶液中，CTAB可与蛋白质和中性多糖形成复合物而沉淀，但不能沉淀核酸和酸性多糖，另外它还能保护DNA不受内源核酸酶的降解。 （2）SDS（十二烷基硫酸钠）:一种阴离子去污剂，可使细胞膜崩解，与膜蛋白疏水部分结合并使其与膜分离，使蛋白变性。 （3）PVP(聚乙烯吡咯烷酮):是酚类化合物的螯合剂，可与多酚化合物形成复合体，使其不被氧化成醌类。 （4）β-巯基乙醇：抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。 （5）蛋白酶K：用于生物样品中蛋白质的一般降解，将蛋白质降解成小分子肽或氨基酸，使DNA分子分离出来。 2.纯化相关试剂耗材 （1）苯酚：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。 （2）氯仿：克服酚的缺点，加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的迹量酚（酚易溶于氯仿中）。 （3）异戊醇：少许异戊醇可以减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡，有助于分相，保持体系的稳定。 （4）无水乙醇：沉淀DNA，不易沉淀盐类等物质；异丙醇也可沉淀DNA，体积小时间短，但易沉淀盐类物质。 （5）核酸纯化柱：采用硅胶膜作为核酸的特异性吸附材料（高盐低pH值结合核酸），同时去除其他杂质，可以最大程度地回收样品中的DNA（低盐高pH值洗脱），可以用于各物种的DNA提取。操作简单、用时短、纯度高。 （6）DNA提取磁珠：是一种核心为四氧化三铁、表面修饰大量硅羟基的磁性微球，能在高盐、低pH条件下和溶液中的核酸通过疏水作用、氢键作用和静电作用等发生特异性结合，而不与其它杂质（如蛋白）结合，可迅速从生物样品中分离核酸，操作安全简单，非常有利于核酸的自动化和高通量提取。 五. 核酸的保存 短时间（24h内）可放置4℃保存，长期（24h以上）放置于-20℃进行保存，期间避免反复冻融。对于纯度不高、总量较少、完整度不好的非高质量核酸，还需尽早进行后续实验，以防保存时间过长，DNA质量更受影响，进而影响建库和测序质量。 以上为大家列举了在提取过程中经常用到的试剂及原理，给出了核酸保存的建议。要强调的是相同的原理下，不是试剂的去污、裂解效果越好就用的越多，还是要在实际提取过程中，根据提取材料的不同、提取结果的差异，灵活调整实验方案。 目前派森诺有着自己一套科学完整的提取检测流程，申请并通过了多项提取专利，尤其是针对多糖、多酚、多次生代谢物等复杂样本有独特的提取方法。后续也将和大家分享疑难样本的提取心得，希望能给您的科研项目带来帮助~~
