2020-06-29
DNA、RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的分子基础。DNA的遗传信息决定生命的主要性状，而mRNA在信息传递中起着重要的作用。其他两大类RNA，即rRNA和tRNA同样在蛋白质的生物合成中发挥着不可替代的功能。因此RNA在DNA和蛋白质中间起着中介的作用，其重要性不言而喻。
在研究RNA的分子实验中，获得高质量的RNA至关重要，但是有些样本因为细胞结构特殊、代谢产物极其丰富、本身RNA丰度低等因素，影响到RNA提取质量。另外，由于RNA酶的广泛存在并难以消减的顽强特性，使得RNA的抽提纯化更为困难。
那么今天我们针对RNA提取相关知识展开简短的介绍~
一、RNA提取原则
(1) 保证RNA分子的完整性
(2) 排除DNA分子的污染
(3) 排除有机溶剂、金属离子、蛋白质、多糖、多酚、脂类的污染
(4) 获得足量的核酸
(5)方法操作简便，稳定性强
不同组织中RNA丰度示意图
二、RNA种类
有mRNA、rRNA、tRNA、LncRNA、circRNA、miRNA、piRNA、siRNA等
三、RNA提取注意事项
1、操作环境干净无灰尘，严格戴好口罩、手套等。
2、实验所涉及的离心管、枪头、移液器、电泳槽、实验台面等要用RNase抑制剂彻底处理。
3、实验所涉及的试剂、溶液，尤其是水必须确保RNase-Free。
4、选择合适的匀浆方法。
5、选择合适的裂解液。
6、控制好样品的起始量。
7、控制好裂解液与样品量的比例。
8、RNA抽提成功的唯一经济标准是后续实验的一次成功，而不是得率。即综合RNA的得率和纯度。
四、RNA提取原理及常用方法问题
1、 RNA提取原理
RNA提取步骤，大致可分为裂解和纯化。首先对样品裂解，采用机械力、化学试剂等方法将RNA释放出来，随后去除蛋白质、糖、酚、金属离子等杂质，再用无水乙醇、异丙醇沉淀或载体吸附RNA，之后洗涤溶解即可得到核酸。
2、RNA提取常用方法
异硫氰酸胍/苯酚法（如Trizol法）
试剂盒过柱法
磁珠法
改良方法
3、RNA提取过程中常见问题
五、几种难提取样本案例
以上介绍了RNA提取中的一些小知识点，那么接下来我们简单列举几种特殊样本的采集要求及提取结果~
1、全血样本
样本采集：一般是抗凝血与TRIzol LS按体积1:3的比例混匀，立即液氮速冻15min以上，随后-80℃保存，送样量不低于3mL。
独特优势：实验室在原有TRIzol的提取方法上进行改良，提取的得到的RNA纯度和得率较正常TRIzol法效果更佳。
结果对比：
2、植物样本
样本采集：在活体状态下擦净组织表面灰尘和杂质（尽量选择幼嫩组织），随后取样，迅速放入预冷好的已写好编号的RNase-free的螺纹冻存管中，立即液氮速冻15min以上，随后-80℃保存。
2.1 淀粉含量高样本（比如：水稻胚乳）
独特优势：公司拥有发明专利的CTAB+TRIzol改良法，能有效去除淀粉、得到高纯度高质量的RNA。
结果对比：
2.2 多糖多酚类样本（比如：茶叶）
独特优势：对现有试剂盒进行改良，加入前处理后，提取核酸纯度有明显提升，利于后续的建库测序和分析。
结果对比：
2.3 油脂含量高样本（比如：油菜籽）
结果展示：
结果展示：
图为干燥的苦荞种子提取检测结果
3、动物样本
样本采集：快速从动物活体取材获得组织后，立即用预冷的RNase-Free 水进行漂洗，以去除血渍和污物，迅速将组织放入预冷的RNase-Free带螺旋帽的 2.0 mL的冻存管中，立即液氮速冻15min以上，随后-80℃保存。
3.1 脂肪组织
脂肪组织单位体积内细胞数少，且单位细胞内RNA含量相对较少，这增加了从脂肪组织提取RNA的难度，对于脂肪组织，需要客户加大送样量，送样量应为常规样本量的3-4倍。公司有专门针对脂肪组织的提取方法，所提取得到的RNA纯度较高，完整度好。
结果展示：
图为小鼠脂肪组织提取检测结果
3.2 软骨组织
软骨组织中含有大量的水分和细胞外基质蛋白，软骨细胞只占整个组织重量的3%左右，并且软骨细胞又被大量软骨基质所包裹，细胞不易从基质中分离出来，这样在常规硫氰酸胍法提取中相当数量的软骨细胞仍被在基质包裹中，未能从基质中分离出来，由此造成RNA得率很低；另外基质糖蛋白与RNA会形成共沉淀，使RNA难以被进一步纯化。目前公司在现有试剂盒的方法上进行改良，增加前处理，得到的RNA纯度和总量能满足后续的常规建库需要。
结果展示：
图中为鸡软骨组织提取检测结果
