2020-07-06
烈日炎炎，暑期将至，空调可以抵御高温的折磨，却抵挡不住派森诺众位客户的热情。目前派森诺转录组测序产品中，真核生物mRNA文库构建的方式有两种，分别是真核非链特异性转录组文库（又称普通转录组文库）和真核链特异性转录组文库，随着转录组研究的不断深入，真核链特异性转录组文库越来越受到大家的青睐。那么问题来了，什么是“链特异”？为什么选择“链特异”？何时选择“链特异”？
今天小编就带领大家一起细数一下“链特异”与“非链特异”文库的那些事，相信看完你就能找到答案。
01、什么是链特异性转录组测序？
链特异性转录组测序（strand-specific RNA-seq）是指在构建测序文库时，将转录本的方向信息保存到测序文库中，测序后的数据分析可确定转录本是来源于基因组的正链或负链。与普通转录组测序相比，它更能准确地统计转录本的数量和确定基因的结构，同时可以发现更多的反义转录本，而这些反义转录本对基因的表达调控可能起非常重要的作用，此外还可能发现新的基因，对研究基因结构和基因表达调控都具有重要意义。
02、普通转录组文库和“链特异”文库区别
众所周知，DNA是双螺旋结构且具有正负链之分，通常将携带有编码蛋白质氨基酸信息的核苷酸序列的链称为正义链，另一条链核苷酸序列与正义链互补，称为反义链。简单来讲，“链特异”文库是以RNA反转录的cDNA一条链为模板进行PCR扩增构建的文库，而普通转录组文库是以RNA反转录的cDNA两条链为模板进行PCR扩增构建的文库。因此，普通转录组文库无法区分RNA极性，而“链特异”文库能够有效区分RNA极性，这就是两种文库的区别所在。
03、如何实现“链特异”建库？
与传统普通转录组建库相比，“链特异”建库在实验原理和操作步骤上又有何差异呢？目前，市面上“链特异”建库方法有多种，而小编使用的是最普遍的dUTP法，即在合成cDNA第二链时用dUTP代替dTTP，然后在PCR富集之前使用UDG将含有U的DNA链水解掉，这样就只有第一链保留下来，即可知道测序得到的转录本是来自于正义链还是反义链。话不多说，直接上图比较一下普通转录组建库和链特异建库的流程差异：
PS、课外知识
dUTP法
又称掺U法，首先使用常规的方法从RNA上逆转录出第一条cDNA链，然后在合成第二条cDNA链时，将加入的dNTPs中的dTTP替换为dUTP，使得合成出的第二条cDNA链中会掺入大量U碱基，随后在双链cDNA的两头接上接头，最后在PCR扩增阶段使用UDG酶特异性降解带有U碱基的cDNA链，从而保证得到的转录组文库保留其方向性。
UDG
尿嘧啶-DNA糖基化酶：Uracil-DNA Glycosylase，简称UDG，能够特异识别DNA链中的尿嘧啶碱基（U），并且把U碱基进行糖基化，随后将糖基化的U碱基从核酸链上切除，使核酸链上就生成一个缺碱基的空位，然后在脱碱基位点上降解核酸链，使得DNA不能再被DNA聚合酶复制，对RNA无活性，常被用于消除PCR扩增中的参与污染。
04、为何选择“链特异”文库？
从上面二者的操作步骤可以得知，普通转录组建库无法确定RNA的方向性，对于反义转录本的发现、新基因功能注释、基因结构分析及基因表达的精确计算均具有很大的限制，而“链特异”建库可以保留RNA的方向性，测序时可以确定转录本来源于基因组的正义链或反义链，能够很好的克服普通转录组测序的不足，基于此，链特异性建库具有比传统建库更多优势，包括：
（1）定量转录本表达量更精确
由于“链特异”文库可以保留RNA的方向信息，因此在计算某些转录本的表达量时，可以排除来自其互补链上的转录本表达的干扰，使得基因定量更精准。
（2）可变剪切事件检测更准确
链特异性文库可以排除反义链上转录本的影响，使可变剪接事件的假阳性率降低。已知circRNA由反向剪切形成，在发掘新的circRNA时，链特异性的测序方式有助于提高circRNA检测的准确率。
（3）提高非编码转录本的检出率，发掘潜在顺式天然反义转录本
反义转录广泛存在于真核生物中，且在发育、代谢等多种生物学过程中具有非常重要的调控作用。链特异性文库可以提高反义链上非编码转录本的检出率，同时也便于确定哪些位于基因间的非编码转录本的方向。
（4）更好预测原生生物操纵子（operon）
原核生物的基因为多顺反子结构，如果对正反义转录本上的基因不加区分，那么对应位置的基因表达量会计算不准确，对操纵子以及基因结构的预测也更不准确。“链特异”文库可更准确实现对操纵子鉴定与分析。
（5）转录本组装更高效、真实
普通转录组组装出来的unigene既包括编码转录本，也包括一些非编码转录本（如lncRNA），若不区分正反链，那么有互补配对关系的编码与非编码转录本会被组装成一条转录本，所以“链特异”文库可明确转录本的方向性，在进行无参转录本组装时显得很有必要。
05、何时选择“链特异”文库？
说了那么多，相信大家对链特异性文库已经有了系统的了解，既然链特异性文库有这么多好处，那么该何时将这些好处加以具体应用呢？为了更好地促进您的转录组研究，贴心的小编为大家整理了“链特异”文库应用方向的思路参考，若您的转录组研究涉及到以下几个方向（包括但不限于）：
（1）差异基因精准分析；
（2）原核生物操纵子分析；
（3）模式生物结构分析。
不妨果断选择派森诺真核链特异性文库，其优越的性能和广泛的应用定将不负所望！
