2020-07-14
背景介绍
人类基因组图谱及其初步分析结果的报道,以及多种模式生物、重要生物基因组全序列的完成,标志着结构基因组学的研究已取得重大进展。随之而来，生命科学研究进入所谓的“后基因组时代”。一个以揭示基因组的功能及调控机制为目标的功能基因组学的研究将是今后几代科学家不懈奋斗的目标。功能基因组学的研究是21世纪国际研究前沿之一，也是最热门的研究领域之一。
功能基因组学是基于基因组序列信息，利用各种组学技术，在系统水平上将基因组序列与基因功能(包括基因网络)以及表型有机联系起来，最终揭示自然界中生物系统不同水平的功能的科学。前人在实验手段及技术方面做了大量的研究就探索，用于确定一个基因有什么功能，为什么这个基因有这样的功能，影响同一性状的不同基因之间有没有什么联系……今天小编就带大家一起来了解下其中一项常用的验证手段-酵母双杂交技术。
研究方法
1、实验材料
两个烟草品种的不育（CMS）系和保持系：
（1）yunyan85的保持系（YY85）及其不育系（sYY85)；
（2）zhongyan90的保持系（ZY90）及其的不育系（sZY90）。
2、研究思路
烟草属于茄科，目前，茄科的线粒体基因组数据大多为二代测序数据，缺少第三代测序数据，且植物线粒体基因组的结构非常复杂，需要第三代测序技术，以获得更加优质的基因序列。而正常线粒体基因组和不育线粒体基因组之间的比较分析将有助于研究不育机理，并筛选造成植物不育的相关基因。
因此本研究分为两个部分，首先是使用PacBio和IlluminaHiseq技术对两个烟草品种（YY85，sYY85，ZY90和sZY90）的不育系和保持系的花蕾的线粒体基因组进行了测序，并通过基因组de novo测序的比较分析获得一些与不育相关的候选基因，然后使用酵母双杂交技术进一步验证了参与不育机制调控的相关蛋白之间相互作用强度的差异。
研究结果
1、线粒体基因组特征和基因含量的比较分析
比较了YY85，sYY85，ZY90和sZY90的线粒体基因组特征。不育系的基因组显著大于其相应保持系的基因组，比后者扩展了约30–60kb。双链断裂（DSB）修复可能发生在编码DNA或非编码DNA上，二者分别是准确的和不准确的。大多数DNA修复是通过DSB的产生来介导的，非编码序列中不正确的修复性能往往会引入非同源序列。这使得非编码DNA进化很快，以至于植物线粒体基因组经历了重大的重排和扩展。
四条线粒体基因组序列的对比分析
在四个线粒体基因组中共发现30个保守的编码基因。atp9，nad3，sdh3，cob，rpl5，rps14和mat-R，以及ccmC，rpl2和atp4的存在均显示了保守编码基因的差异。值得注意的是，在YY85和ZY90中都有另一个nad3（nad3-D2）拷贝。减少的nad3拷贝数可能会导致该基因在sYY85和sZY90中的表达下降，这可能会进一步减少线粒体能量供应和无功能的花粉生产。
四个线粒体基因中的保守基因
2、保持系和不育系中线粒体基因组结构的重排
根据四个线粒体基因组的同源序列和同义分析，分别在YY85，sYY85，ZY90和sZY90中发现了45、52、25和27个同源序列区域（同义嵌段）。在YY85/sYY85和ZY90/sZY90的同线区域中，有11个和9个共线性区域，24个和13个易位区域，3个和1个反向区域以及14和4个同时的反向和易位区域。在两个烟草品种的不育系和保持系中，超过60％的同义嵌段被重排，并且线粒体基因组之间的同义嵌段顺序存在显著差异。
具体如下图所示：
线粒体基因平行关联图
（橙色是正向链，蓝色是反向链，方框中颜色深度表示相似，完全填充表示100%相似）
3、烟草中与不育相关的候选基因
在烟草中，在烟草属内的各品种之间或烟草与茄科的其他属之间产生了同质系以及原生质体融合，以获得用于育种和遗传研究的不育系。线粒体基因组的重排可能会产生新的嵌合ORF。大多数鉴定出的与CMS相关的基因是许多作物物种中的嵌合ORF，它们与编码ATP合酶或细胞色素C氧化酶亚基（例如atp6和cox2）的基因融合。但是，尚未在烟草线粒体基因组中发现与CMS相关的嵌合ORF。这种现象表明，烟草中与CMS相关的基因与其他植物中的不同。在此次研究中，在两个烟草品种的两个CMS系中都鉴定出了特定的蛋白质编码基因和ORF，它们被认为是烟草中与CMS相关的候选基因。
4、候选不育系相关基因atp6的蛋白互作验证（PPI）实验
根据以前的研究，对于所有候选CMS相关基因，ATP6和CMS之间的关系至关重要。尚未在烟草线粒体基因组中发现与CMS相关的嵌合ORF，因此拟南芥被选作PPI预测的相关物种。ATPase序列的比对结果表明，烟草与拟南芥的相似度超过70％。因此，推测该软件预测的拟南芥的PPI结果可以更好地反映烟草的PPI趋势。在预测所有ATPase蛋白的PPI后，结果清楚地表明ATP9可能与ATP6相互作用。因此，使用酵母双杂交技术选择了ATP6和ATP9来验证保持系和CMS系之间潜在的PPI关系差异。结果表明，保持系（图C）中ATP6和ATP9的PPI弱于CMS系（图B）。PPI强度的这种差异表明ATP6基因可能是关键基因之一，并且是与植物不育相关的重要因素。在未来的研究中，CMS相关的差异将突出ATP6，并进一步扩展到整个线粒体基因组，以发现更多可能在不育中发挥关键作用的关键基因。烟草线粒体基因组的全面研究有助于增进我们对茄科作物不育机理的了解。
ATP6-ATP9酵母双杂验证图（A、阳性对照；B、不育系；C、保持系）
总结
对YY85，sYY85，ZY90和sZY90的线粒体基因组的综合分析表明，广泛的结构变异可能与不育有关，更具体地说，四个候选CMS特异性基因以及16个候选CMS特定的ORF与CMS机制密切相关。它们不仅代表了与CMS相关的候选基因，而且还可以用作鉴定烟草中CMS系的分子标记。值得注意的是，针对ATP6的PPI实验进一步支持了该候选CMS特异性基因的重要性以及我们研究结果的有效性。线粒体基因组信息的独立分析不足以揭示CMS机制。因此，迫切需要来自多组学研究的更多有价值的信息来进行后续工作。
TIPS
植物三系简称三系。植物三系是指的雄性不育系，雄性不育保持系，雄性不育恢复系这三系。
不育系，不育系就是雄性不育系的简称。是指植物的雄性器官退化或发育不正常,丧失了受精能力，自交不结实，但是雌蕊正常，可以接受其他植物品种的正常花粉可以结实的品系，所以称为雄性不育系。
保持系，保持系就是雄性不育保持系的简称。不育系本身没有花粉，保持系不能结实，为了年年有大量的纯不育系种子，每一个不育系必须有一个专门给它授粉，使所得的下一代仍为不育系的品系。这种使不育系能传种接代的植物品系，称为雄性不育保持系。
恢复系，恢复系就是雄性不育恢复系的简称。保持系只能为不育系解决传种接代问题，不能解决生产上应用的大量杂交种。必须用另一些特定品种给不育系授粉，使所得种子种出来的植株雄蕊恢复正常，并能自交结实，这些品种或品系，称为雄性不育恢复系。
参考文献：
Ruyi Wang , Xunhui Cai , Shengnan Hu ,et al.Comparative Analysis of the Mitochondrial Genomes of Nicotiana tabacum: Hints Toward the Key Factors Closely Related to the Cytoplasmic Male Sterility Mechanism[J]. Frontiers in Genetics. 2020, 11:257-272.
