2020-08-04
2020年6月《nature communications》期刊发表了一篇题为“A megaplasmid family driving dissemination of multidrug resistance in Pseudomonas”的文章，揭示了假单胞菌中的大质粒家族中的多重耐药性的特性及相关大质粒的进化关系。 一、研究背景 抗生素的耐药性（AMR）传播被认为是对人类健康的一个关键的全球挑战，ESKAPE病原体（粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属）是全世界医院内感染的主要原因。特别是铜绿假单胞菌，该菌通常与多重耐药性（MDR）相关，已被世界卫生组织列为与抗生素耐药性相关的重要病原体。在泰国，铜绿假单胞菌对碳青霉烯的耐药性是一个日益严重的问题，之前的研究试图阐明在临床分离的铜绿假单胞菌中碳青霉烯耐药的遗传基础，但对质粒的作用知之甚少。本文采用二代+三代的测序方法对铜绿假单胞菌进行测序，获得假单胞菌中与多重耐药相关的质粒，通过比较基因组等分析研究其水平转移能力以及进化关系等。 二、材料与方法 1、实验材料 从泰国曼谷玛希隆大学Ramathibodi医院获得48株与不同感染相关的分离菌株，对48株分离株进行药敏实验，根据结果将其分为敏感型、中间型以及抗性菌株。 2、测序方法及组装 （1）二代：从48株中选取23株敏感型和抗性菌株进行Illumina Miseq测序，测序数据采用A5-Miseq进行组装； （2）三代：选取抗性最强的3株进行Pacbio RSII测序，测序数据采用HAGP v.3进行组装。 3、基因组注释、预测及比较基因组分析 对测序获得的序列进行基因组拼接组装以及基因预测，对获得的序列进行比较基因组分析。 三、实验结果与分析 1、临床分离株的抗菌药敏性 对收集到的48株与不同感染类型相关的铜绿假单胞菌分离株进行药敏实验，其中有9株对5种抗生素全部具有抗性，有6株对5种抗生素中的4种具有抗性。 2. pBT2436和pBT2101 抗生素耐药性研究 选取抗性最强的3株分离株2101、2436和4068进行Pacbio测序，2101和2436分别得到了一条完整染色体（6,782,092bp、6,573,638bp）和一个环形质粒（命名为pBT2101（423kb）和pBT2436（440kb））。对这两个质粒进行比较发现，pBT2101有一个重复区域（RR1）和一个可变区（VR1），pBT2436有两个重复区（RR1和RR2），但没有可变区。其中分离株4068组成5条contig，有一个51kb的质粒但是不含有抗性基因，故本文未做进一步研究。 对pBT2101和pBT2436进行注释，发现RR1区含有大量的AMR基因，包括一些共有的和特有的mer操纵子、转座酶、整合酶、重复序列，但在核苷酸水平上基因含量、序列同一性及排列位置上存在差异；同时转座子插入导致一部分基因长度发生变化从而导致共有区域存在一定的差异。对两个质粒进行IS序列预测，得到8种IS序列类型，其中Tn5393，IS6100和TnAs3为两者共有的，预测得到的序列中包含一部分抗性基因，这表明IS序列在获得不同来源的抗性中起关键作用。 将pBT2436染色体进行比对发现，与菌株PAO1具有相同的染色体序列，菌株2436、PAO1与pBT2436的RR2区比对仅有78%的相似性，排除RR2区来源于菌株染色体；将RR2区序列在数据库中进行blast，发现同源性最高的为A. hydrophila WCHAH045096，与非相关质粒pBKPC18-1(C.freundii) 和 pMKPA34-1(P. aeruginosa)相似性也比较高，主要区别是存在与各种IS相关的基因，暗示了这些基因在传播中的作用。这些抗性区的动态性质与其余质粒主链的一般保守性相反，表明抗性基因已在不同质粒背景中独立组装。 3. 临床分离株中相关大质粒的分布 为了确定相关质粒是否存在于同一家医院的其他P. aeruginosa中，选择了23种耐药性较高和耐药性较低的临床分离株（包括2101和2436）进行二代测序。从基因组中提取的多基因组序列类型（MLST）和基于kmer序列比较表明，分离株在遗传上高度多样化。 以pBT2101和pBT2436为参考基因组对测序分离株进行mapping，分离株3583和638分别与pBT2101和pBT2436保持高度相似性，表明这两个分离株中存在相关质粒。其中分离株2436和638来源于同一患者但是不同来源的样品中分离得到的，它们具有相同的序列（ST)；来源于不同患者的分离株2101和3583在7个MLST基因座中的6个具有相同的序列，它们的质粒具有很高的一致性，但分离株3583中的质粒仅携带一个抗性基因拷贝而不是两个。 4. pBT2436-like大质粒家族 为了更好的研究与多药耐药性质粒相关的大质粒家族，以pBT2436和pBT2101序列在NCBI数据库中进行blast，结果得到13种其他大质粒，大小在370至501 kb之间，编码基因在456至623之间。其中10个大质粒属于P. aeruginosa，另外三个属于P. putida（人的尿路感染有关）， P. citronellolis 和 P. koreensis。 对15个完整大质粒序列的比较分析显示，它们具有较高的同义度和广泛的序列相似性，检测到的变异分布在整个基因组的离散位点上（主要集中在富含AMR基因、转座酶和整合酶基因的大区域），但大质粒组的任何其他成员都不存在pBT2101 的7.7kb可变区（对VR1进行注释发现该去并无AMR基因）。 5、pBT2436-like大质粒的核心和辅助基因组分析 基于15个质粒基因组进行比较得到261个直系同源蛋白质组组成的核心基因组，平均每个质粒约有48%的核心基因组（范围为42–57％），泛基因组分析得到1164个共有基因家族。核心基因组和泛基因组的稀释和积累曲线表明，随着基因组数量的增加其核心基因组的数量不会受到太大影响。 6、 pBT2436-like大质粒家族的系统发育分析 基于（a）核心基因的核苷酸组成（n = 105）和（b）泛基因组（存在或不存在蛋白质簇）构建系统发育树，发现： （1）在中国分离得到5个巨质粒(包括P.putida)； （2）两个大质粒pOZ176（来自中国）和pJB37（来自葡萄牙）； （3）两个了解很少的大质粒（菌株AR_0356和AR441）分别聚集成簇。 pBT2436和pBT2101通过基因组分析比通过核心基因组分析更紧密地聚集在一起，这表明由于加入了辅助基因（与AMR相关）而导致了一些融合。 根据AMR基因含量绘制热图，发现： （1）在非铜绿假单胞菌(p1和pRBL16)中发现的两个巨质粒来自于非人类来源，不具有AMR基因； （2）质粒pST153从中国一例泌尿系感染菌株P. putida 中分离得到的，与其他来源于中国的质粒在AMR基因上具有一定的相似性。 7、pBT2436-like巨质粒家族的广泛分布 为了确定大质粒家族的广泛分布，将pBT2436序列放到NCBI上检索假单胞菌基因组中相关的大质粒，从比对上的基因组中获取其原始数据。以pBT2436序列为参考基因组进行mapping，发现mapping率最高为96.6%，是1986年从日本分离得到的P.montelii中的质粒；比对上最早的是1970年从日本发现的P. aeruginosa，mapping率为86.3%。从核心基因中选择4个核心基因进行系统发育树构建，揭示了新的多样性模式。值得注意的是，只要4个系统发育标记基因来推断树，表明这些基因可以形成一个分型系统的基础。 8、大质粒的稳定性和适应性成本 通过使宿主细菌在非选择性培养基中循环生长三轮（约60代）并筛选维持妥布霉素抗性的方法来检测pBT2436的稳定性，结果并没有抗性丧失。为了解大质粒获取的适应性进行竞争性适应性检测，在检测中带有大质粒的P.fluorescens直接与等基因的、标记不同的无质粒竞争者竞争。令人惊讶的是，尽管pOZ176和p1的规模很大，但它们都没有对竞争增长造成显著的成本；但检测到两种质粒均大量转移至竞争者中，并且未检测到pOZ176或p1的丢失。这些实验数据表明，由于适应性成本低，传播速率高和基因含量高，pBT2436-like大质粒可能是环境中假单胞菌之间传播抗药性的有力载体，这与基因组分析结果一致。 四、结论 1.获得了两个紧密相关的大质粒（> 420 kb）的完整序列，携带着位于离散、复杂和动态耐药区域的大量抗生素耐药基因，并揭示了广泛的复制和重组事件。 2.全面的基因组学和系统基因组学分析表明： 1）大质粒中包含假单胞菌不同成员中新出现的家族属，并与多种来源（地理，临床或环境）相关； 2）大质粒编码各种适应生态位的辅助性状，包括多药耐药性； 3）大质粒家族的辅助基因组具有高度的灵活性和多样性 3.对可用数据库的分析中可以推断出大质粒家族的历史，表明携带多个抗性基因的成员至少可以追溯到1970年代。 点击阅读全文：https://www.nature.com/articles/s41467-020-15081-7
