2020-08-12
RNA甲基化作为当下“国自然”研究热点，热度只增不减。小派君还会持续给大家带来更多知识与研究思路，还没有关注我们的小可爱们来波关注吧~
m6A（RNA甲基化）检测方法，你选对了吗？（点击查看）
今天我们要给大家分享的是RNA甲基化的研究思路，带大家更好的理解RNA甲基化测序（MeRIP-seq）技术的应用。
在介绍研究思路之前，我们要知道m6A甲基化过程中涉及的这3类重要的酶：
1、Writers，甲基化酶，催化m6A甲基化的发生；
2、Erasers，去甲基化酶：去除m6A甲基化的修饰；
3、Readers，m6A识别蛋白，识别m6A修饰位点。m6A修饰被不同的reader识别会发挥不同的生物学功能，如影响mRNA的剪接、出核、定位、翻译和稳定性等。
一、构建m6A转录组修饰谱
构建m6A转录组修饰谱，通过MeRIP-Seq看整个转录组的m6A修饰情况，得到发生m6A修饰的基因以及m6A的修饰水平。也更适合多数非模式物种来做，以及在没有条件开展较多生化实验以及分子互作机制的时候选择。如果觉得单一组学太单薄，可以做多组学整合研究，基于多组学数据寻找表面调控规律。
当然，若不想看整个转录组的m6A修饰情况，可以做MeRIP-qPCR，针对目标基因看m6A修饰水平；若只想看整体m6A水平变化，不看基因层面的，可以用Dot blot、LC-MSMS、Elisa等方法看整体修饰水平的变化。
参考文献：
Jabs S, Biton A, Bécavin C, et al. Impact of the gut microbiota on the m6A epitranscriptome of mouse cecum and liver. Nat Commun. 2020;11(1):1344. Published 2020 Mar 12.
二、m6A甲基化与转录组联合分析
MeRIP-Seq与RNA-Seq联合分析，可以同时得到基因的m6A修饰水平与表达水平，在结果中可挖掘Writers的靶基因，并结合RIP实验验证。这两个组学整合后的结果分5种情况：都上调、都下调、m6A水平上调但表达水平下调、m6A水平下调但表达水平上调、以及均无变化。由于不同reader会引起RNA的命运朝着不同方向改变，因此联合分析的结果可以通过生化与实验去验证，挖掘分子机制。
参考文献：
Song T, Yang Y, Wei H, et al. Zfp217 mediates m6A mRNA methylation to orchestrate transcriptional and post-transcriptional regulation to promote adipogenic differentiation. Nucleic Acids Res. 2019;47(12):6130-6144.
三、关键酶与下游基因靶向关系验证
通过RNA-pull-down与RIP等实验，探索与目的基因特异性结合的蛋白。这可以用作RNA甲基化关键酶与基因之间互作关系的挖掘与验证。由于目前已明确鉴定到了很多writers、erasers与reader蛋白，并且也明确了很多reader的功能，这样的话，如果发生m6A修饰的目标基因能被一个影响RNA稳定性的蛋白结合，那么就可以做RNA稳定性实验来进一步验证我们的发现；如果发现m6A修饰的基因被影响翻译效率的RNA结合，那么可以做WB等蛋白定量实验来验证。
参考文献：
Li T, Hu P S, Zuo Z, et al. METTL3 facilitates tumor progression via an m6A-IGF2BP2-dependent mechanism in colorectal carcinoma[J]. Molecular Cancer, 2019, 18(1).
四、敲除/过表达RNA甲基化关键酶研究下游机制
该思路可用于RNA甲基化研究的第一步，通过敲除甲基化酶或者过表达去甲基化酶，观察表型，以确认某关键表型是否受RNA甲基化调控，若是，则开展RNA甲基化测序、转录组测序等，来研究其中m6A修饰的调控机制。该思路也可以在做完RNA甲基化之后作为进一步的验证手段，在获得基因m6A修饰情况后，通过敲除或过表达readers，看reader的靶基因的命运，再进一步观察相应表型。
参考文献：
Lin X, Chai G, Wu Y, et al. RNA m6A methylation regulates the epithelial mesenchymal transition of cancer cells and translation of Snail.[J]. Nature Communications, 2019, 10(1).
五、m6A甲基化与翻译组联合分析
通过组学手段或者目标基因/蛋白的定量手段获得基因的表达水平与蛋白表达水平，再通过m6A修饰水平与翻译组检测技术，以及RIP实验等，寻找基因的转录水平与蛋白表达水平的背后机制。有部分reader在识别m6A修饰位点之后，会引起目标RNA的稳定性、降解、翻译效率等问题。
参考文献：
Vu L P, Pickering B F, Cheng Y, et al. The N6-methyladenosine (m6A)-forming enzyme METTL3 controls myeloid differentiation of normal hematopoietic and leukemia cells.[J]. Nature Medicine, 2017, 23(11): 1369-1376.
六、LncRNA甲基化介导的表型变化的分子机制研究
虽然大部分m6A修饰更多的集中在mRNA中，不过也有研究表明lncRNA上的m6A修饰也会影响lncRNA的命运，如对miRNA、蛋白的结合能力等，进而调控不同通路来影响生物学表型。
参考文献：
Zhang S, Zhao BS, Zhou A, et al. m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program. Cancer Cell. 2017;31(4):591-606.e6.
