2020-08-14
上次通过简单的入门知识，速看！高分文章的新阵地——空间转录组，技术入门来啦！(点击查看)，我们对空间转录组的基础信息做了一个了解，那么，经过手术或者是基础实验，获得了一系列肿瘤及其临近组织的组织样本和病理切片，想要发表高分文章，针对手上的资源，可提出怎样的生物学问题？又要如何设计实验解决提出的问题呢？
下面咱们就以这篇今年发表于nature biotechnology的关于胰腺癌的文章为例，来聊聊这个文章思路的关键问题。
文章中对思路进行了概述：
整理下来即为：
首先，作者对两例胰腺癌患者的样本进行了单细胞测序，发现了一个非常有意思的结果：PDAC-A病例中有两类不同类别的肿瘤细胞；而PDAC-B病例中只有一种类别的肿瘤细胞（图1）。于是，一个生物学问题产生了：这两个病例中的总共三类肿瘤细胞，彼此之间有怎样的差异？在基因表达水平，信号传导水平，空间分布水平，以及与其它类别细胞间通讯水平，是否存在差异，这些差异，以怎样的形式进行阐释？
图1：单细胞测序结果展示
针对上面的问题，主要目的其实就是一方面想要得到客观全面的信息，而一方面想要聚焦于病理切片去阐述一些信息，对于切片方面的进一步研究，空间转录组测序研究无疑是较优选择。
其次，作者对上述两例病例也收集了病理切片样本，针对病理切片进行空间转录组测序分析，最后通过MIA (Multimodal intersection analysis) 分析将单细胞分析结果和空间转录组结果进行联合分析，获得了一些关键性结果：
01、关注空间转录组数据的特定亚群内，分析在这一区域的各单细胞转录组数据亚群，旨在揭示肿瘤区域内的含有哪些细胞类型。结果显示，在PDAC-A中，肿瘤区域除了富含肿瘤细胞，也富含成纤维细胞，而在PDAC-B中，则并不富含成纤维细胞（图2，3）。
图2：空间转录组（ST）结果展示（a，b:带注释的PDAC-A和PDAC-B肿瘤冷冻切片。c，d：PDAC-A和PDAC-B ST数据集中的三个基因的标准化表达水平。e，f：PDAC-A和PDAC-B ST点阵的聚类）
图3：不同样本空间转录组的空间亚群内不同细胞类群的比较
02、关注单细胞数据的特定亚群，分析这些亚群分布在哪些空间转录组数据的亚群中，旨在揭示同一类别的细胞，分别聚集分布在肿瘤的哪个区域。根据单细胞转录组的细胞亚群分类结果，联合空间转录组数据显示，以胰管细胞为例，在PDAC-A中，在肿瘤区域内富含APOL1高表达，即指示缺氧环境的胰管细胞以及末梢导管。在PDAC-B中，则不含任何胰管细胞 （图4）。
图4：胰管细胞亚群内在不同空间位置的分布比较
03、由于在前面scRNA-seq数据中发现PDAC-A的两个癌细胞亚群在遗传上的基因水平和转录水平上都是不同的，因此为了更好的研究这两个亚群，又额外取了2张PDAC-A肿瘤不同区域的组织切片进行了ST实验和分析，最后综合三个PDAC-A组织切片ST数据和scRNA-seq数据，MIA分析发现成纤维细胞在癌细胞亚群1中富集程度高，在亚群2中富集程度则比较低或者无富集。这种模式表明，癌细胞亚群1可能在组织中引起特定的基质反应，或者癌细胞亚群2可能与组织中的成纤维细胞互斥（图5）。
图5：癌症亚区域显示出不同的细胞类型和亚群富集（a–c，确定3个PDAC-A的ST癌症区域中的子区域。d，在PDAC-A中鉴定的癌症的子区域的MIA图以及在图1和2中鉴定的细胞类型和细胞亚群。）
04、关于癌细胞的scRNA-seq数据的最新研究表明，多种癌症类型中都有其独特的细胞状态，因此作者考虑使用MIA方法将癌细胞状态映射到不同的空间组织区域并表征它们与其他细胞类型的相互作用。
为了这一目的，文中加测了一个PDAC的 scRNA-seq，综合分析scRNA-seq数据集后定义了PDAC癌细胞之间的三个基因表达模块，其中应激响应模块对本研究尤为重要。之后通过来自6个患者的样本队列的10个ST实验数据和MIA分析，发现了应激模块高表达基因与炎性成纤维细胞之间的强富集关系。
最后通过结合数据库中的一些之前的普通转录组数据发现，只有应激反应基因模块与炎性成纤维细胞特征显著相关。作者追加了免疫荧光实验与免疫荧光切片相邻的组织切片的H＆E染色实验，进一步证明炎性成纤维细胞与表达应激反应基因模块的癌细胞之间存在信号传导关系。并通过对其他肿瘤的数据的MIA分析，验证了MIA方法在研究细胞群与空间受限结构之间的关系上的实用性(图6)。
图6：绘制癌细胞状态与其他细胞亚群之间的关系图
小 结
作者整体上就关注了两个变量：空间区域和细胞类型。主题思路就是固定一个变量，分析另一变量在该变量中的情况。
那么，除了上述两个变量，是否存在其它变量，可以进行更全面的分析，以解释更精确的生物学问题呢？答案是肯定的。变量3可以是信号通路，变量4可以是存在受体和配体互作关系的细胞间通讯等等。接下来的文献解读专题，我们将通过另一篇science的文章，解读作者如何分析空间区域、细胞类型和信号通路之间的关系，通过这样的分析，以帮助解决这样的生物学问题：针对某一感兴趣的基因，是否可以通过其空间表达模式筛选到其共表达的基因，研究参与同一生物学过程的未知基因的生物学功能，进一步揭示感兴趣生物学过程的分子机制。感兴趣的伙伴，请密切关注我们的后续更新。
升级版的10x Genomics Visium空间转录组技术相对于文章使用的早版的ST技术，单细胞分辨率上表现更加卓越，助力高分文章更是不在话下！想要研究空间表达情况，要获取无偏数据、甄选关键数据的你，赶紧行动起来吧!
文献索引：
Moncada R, Barkley D, Wagner F, et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas[J]. Nat Biotechnol. 2020;38(3):333‐342. doi:10.1038/s41587-019-0392-8
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41587-019-0392-8
