2020-08-20
高通量测序（NGS）的数据产出和数据质量跟多个因素息息相关，其中主要影响因素为文库质量、测序试剂和仪器状况，由于测序试剂和仪器状况不易控制，因此，为了保证测序质量，需要严格把控文库质量。好的文库千篇一律，差的文库五花八门，今天，让我们一起看看质量差的文库究竟差在哪，以及什么样的文库会被定义为“差的文库”。
定义一个文库是好是差，可以从三个方面衡量：文库片段、文库碱基复杂度和文库浓度。
一、文库片段
文库片段目前大多数公司都是使用微流控芯片技术的仪器进行检测，如PerkinElmer公司的LabChip GXII Touch（图1），Agilent公司的2100 Bioanalyzer（图2）、Tapestation（图3）、Fragment Analyzer（图4），以及Bioptic公司的Qseq系列（图5）等仪器。
图1
图2
图3
图4
图5
相较于传统的琼脂糖凝胶电泳，采用微流控芯片技术可以更好地获得文库的片段大小范围及文库片段的精确分布，且灵敏度更高，含量低的片段也可以检测到，检测过程简单方便、效率高。构建好的文库中除了目的片段，还可能存在二聚体、小片段、大片段等非目的片段的存在，这些非目的片段会导致文库定量不准确，同时还可能影响后续的上机测序，降低测序数据的产出和测序的质量，下面我们举几个例子：
1、二聚体污染：
二聚体包括接头二聚体和引物二聚体，通常长度小于100bp的是引物二聚体，长度在120bp左右的是接头二聚体。文库中如果存在二聚体，在上机测序时，二聚体会与flowcell上面的锚定序列结合，并且可以通过桥式PCR扩增形成簇，从而降低测序的有效数据产量，同时由于二聚体序列短，在长簇时存在优势扩增，且是固定序列，其碱基复杂度低，且长度短，会降低测序的Q30，影响clean reads的过滤率。二聚体污染的文库的检测结果如图6所示。
图6
2、小片段：
在检测结果中，除了目的片段外，还存在其他的小片段，这种情况产生的原因可能是片段化过程中打断的条件不合适，部分片段被打断得太小，或者是文库分选时磁珠比例不当导致。小片段的存在会影响文库浓度的定量，进而影响文库的产出；除此之外，小片段的插入偏短，测序时会测通，产出了冗余的数据，影响有效数据的占比。小片段污染的文库的检测结果如图7所示。
图7
3、大片段：
在检测结果中，除了目的片段外，还存在其他的大片段，这种情况产生的原因有两种，第一种是类似小片段存在的原因，即可能是片段化过程中打断的条件不合适，残留部分较长的片段，或者是文库分选过程磁珠比例不当导致；第二种原因是文库的扩增循环数太高，文库过度扩增自我互联形成多聚体，在检测时就出现了大片段。大片段在上机测序时，可能会跨孔长簇，测序仪会过滤掉这部分的数据，降低产出。大片段污染的文库的检测结果如图8所示。
图8
4、宽峰：
文库的片段分布宽，这种现象通常称为宽峰，宽峰产生的原因同样是打断条件不合适，或者文库没有进行分选或分选条件不合适。宽峰的文库由于片段分布广，难以确定文库的准确浓度，因此文库的数据产出不好控制。宽峰文库的检测结果如图9所示，片段分布广，分布在200bp-1000bp。
图9
5、插入片段偏大：
高通量测序的特点是通量大，读长短，如果需要测序的文库长度太长，一方面会影响文库浓度的荧光定量，另一方面，在上机测序时可能会跨孔长簇，产生index hopping，降低测序数据的产出和质量。插入片段偏大文库的检测结果如图10所示。
图10
二、文库碱基复杂度
文库碱基复杂度对于测序数据的影响非常大，碱基复杂度低的文库（常见的有甲基化文库、small RNA文库、扩增子文库、pcr-free文库）会影响测序过程中荧光信号的读取，不易产出高质量的数据，因此测序时要保证文库的碱基尽可能平衡，对于碱基复杂度低的文库，可以掺入一定比例的phix文库或者已知的碱基平衡文库混合测序，帮助平衡每个测序cycle产生的荧光信号，从而提高测序的产出和质量。
三、文库浓度
文库浓度质检方法主要有NanoDrop分光光度计法、Qubit荧光计法、qPCR荧光定量法。
三者详细的原理和优劣势在之后的文章中咱们再详细讨论，请各位老师时刻关注派森诺公众号更新~
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