2020-08-27
实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR）是一种通过在PCR反应体系中引入一种荧光物质，对PCR扩增反应中每一个循环产物的荧光信号进行实时检测，以此对初始模板进行定量分析的实验。相对定量指的是在待测样本中目的序列相对于另一对照样本的量的变化，比较对两个或多个不同处理的样本中的基因表达水平的高低变化，得到的结果是比率。
我们为什么要做相对定量呢？
其中非常重要的一点就是对转录组测序的验证。转录组测序是以数学模拟计算表达量，筛选的的基因比较多，一定程度上会有误差，而荧光定量是对特异基因表达量的检测，特异性相对更高。一个所谓数学方法，一个所谓实验方法，干湿结合，才能确保分析结果的可靠性。
另外，相对定量的研究范围很广泛，样品类型可以是动物，植物，细胞，菌体，土壤甚至是病毒RNA。其中研究的RNA可以是编码RNA，也可以是非编码的RNA，如：长链非编码RNA（lncRNA），miRNA，circRNA等，为基因研究提供更多类型。
一．表达水平验证：相对定量
1、实验原理：
提取样品中的总RNA,以其中的RNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。
2、注意事项：
（1）提取保证RNA的完整性
（2）引物设计：根据研究的目的序列，设计引物；建议在正式上机之前进行引物调试，根据CT值范围和熔解曲线判断引物是否有引物二聚体或非特异性扩增，引物是否可用。
（3）内参的选择：选取一定的内参基因，以除去不同标本在RNA产量、质量以及反转录效率上可能存在的差别，进行校正和标准化。不同的内参在不同的组织中表达是有差异的；可以通过查找文献或是选择常用的多个内参进行实验验证。
3、标记物：
荧光定量所使用的标记物可分为荧光染料和荧光探针，其中比较常用的为SYBR Green I 染料和TaqMan探针。
SYBR Green I 是一种结合于所有双链DNA小沟的具有绿色激发波长的染料。游离的染料分子不发光，在新合成链延伸过程中SYBR Green I与DNA双链结合，发出荧光信号，一个反应发出的全部荧光信号与双链DNA量成比例，随扩增产物的增加而增加。
TaqMan探针是单链DNA，两段分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光被淬灭基团吸收；PCR扩增时Taq酶发挥5’-3’外切酶活性，使两种基团分离，从而荧光检测系统可以接受到荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号的累积和PCR产物形成是同步的。
4、验证成功案例：
期刊：INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY
影响因子：3.571
研究背景及意义
多形胶质母细胞瘤（GBM）是最常见的原发性恶性脑肿瘤，尽管近年来出现了多种治疗方法，例如手术，放疗和化学疗法，但胶质母细胞瘤患者的总体生存率并未发生明显变化。胶质瘤干细胞（GSC），具有自我更新的能力和多能性，并且可以诱导肿瘤发生，对神经胶质瘤研究日益重要。因此阐明控制GSC的分子机制可能为开发针对GBM的靶向治疗提供新的信息。而之前的一些研究已经表明，溴结构域和末端外域蛋白，尤其是含溴结构域的蛋白4（Brd4），可能是多种癌症的治疗靶标，但是目前尚不清楚Brd4在多形胶质母细胞瘤（GBM）中的作用和机制。本研究旨在探讨Brd4和溴结构域抑制剂JQ1对神经胶质瘤干细胞（GSC）的抗肿瘤作用的潜在机制。
研究方法
RT-qPCR，蛋白质印迹(western blotting)，RNA-Seq测序和分析，免疫荧光和免疫组化实验等。
验证结果展示
RNG测序实验中，经JQ1处理后的CSC2078基因上调和下调的基因表达模式簇热图见图A。对照组与JQ1处理后CSC2078不同的基因数见图B。对照，JQ1处理组和siBrd4组中PI3K，AKT和p-AKT（Ser473）的蛋白质印迹分析表达结果见图C和F。图G和H则展示了p-AKT（Thr308）在JQ1处理的CSC2078细胞中的Western印迹分析表达结果。最下面的KEGG富集分析气泡图展示了，JQ1处理后，CSC2078的20个显著富集的KEGG途径。这些结果均表明PI3K / AKT信号通路在多形胶质母细胞瘤中起重要作用。
KEGG通路富集分析显示细胞周期显著富集。为了进一步研究Brd4在GSCs中调控细胞周期进展的机制，作者采用RT-qPCR检测了JQ1处理的CSC2078和TS543细胞中与细胞周期相关的基因c-Myc、cyclin D1、p21和p27。发现c-Myc和CyclinD1的mRNA表达水平明显受到抑制，而P21和P27的mRNA表达水平明显上调。
由于AKT可在多种癌症中激活细胞凋亡，作者研究了Brd4对GSCs凋亡基因的影响。作者利用RT-qPCR验证了JQ1和siBrd4对CSC2078和/或TS543细胞中Bim、BAX、Bak、Bcl-2、Bcl-xl等PI3K/AKT信号通路中重要凋亡基因的影响。发现抑制血管内皮生长因子/PI3K/AKT信号通路可导致胶质瘤干细胞的细胞周期阻滞；抑制VEGF/PI3K/AKT信号通路可诱导GSCs凋亡。
研究结论
本研究旨在探讨Brd4和溴结构域抑制剂JQ1对神经胶质瘤干细胞（GSC）的抗肿瘤作用的潜在机制。在体外，JQ1和靶向Brd4的小干扰RNA（siBrd4）抑制GSC的增殖和自我更新。在体内，JQ1显著抑制异种移植GSCs肿瘤的生长。RNA-seq分析表明，PI3K-AKT途径在GBM中起重要作用。通过JQ1处理GSC，血管内皮生长因子（VEGF）和VEGF受体2的磷酸化被下调，从而降低PI3K和AKT活性。此外，用siBrd4或JQ1处理可通过激活参与凋亡的AKT下游靶基因来诱导凋亡。总之，这些结果表明Brd4具有作为治疗靶标的巨大潜力，而JQ1对GBM具有显著的抗肿瘤作用，这可能是通过VEGF / PI3K / AKT信号传导途径介导的。
二．新型冠状病毒检测（探针法应用）
新型冠状病毒检测提取病毒RNA，针对其基因组中开放读码框1ab (open reading frame 1ab, ORF1ab) 和核壳蛋白(nucleocapsid protein, N) 序列设计荧光探针引物。通过Ct值来判断是否为阳性。
结果判定
阴性：无Ct值或Ct≥40。
阳性：Ct值<37，可报告为阳性。
灰度区：Ct值在37-40之间，建议重复实验，若重做结果Ct值<40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性,否则为阴性。
在实验室要确认一个病例为阳性，满足以下条件： 同一份标本中新型冠状病毒2个靶标（ORF1ab、N）特异性实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性。
