2020-09-11
相信不少小伙伴都遇到过这样的疑惑：收到一份转录组测序结果，辛辛苦苦查找文献，挖掘关键基因信息，眼看一篇高大上的文章即将诞生，却卡在了进行qPCR验证这最后一步：我关注的RNA序列在哪里？没有序列信息我要怎么设计引物做荧光定量PCR呢？
莫慌，我们整理了派森诺各种常规转录测序产品的RNA序列信息，下面就一起来看看吧！
1、有参转录组
有参考基因组的转录组项目在进行分析时，我们是将测序reads与参考基因组进行比对，根据比对结果进行基因定量分析，进而进行差异分析的。从分析方法就可以发现，有参转录组的基因信息来自参考基因组，因此基因序列也是来自对应的数据库。
那么，我们如何从数据库中查找目标基因序列呢？我们整理了最常规的两大数据库：Ensembl和NCBI的基因序列查找方法，如果您的基因组也是来自这两个数据库，可点击查看
2、无参转录组
无参考基因组的转录组项目在进行分析时，我们首先要基于测序结果拼接出一个“基因集”，并对其进行注释，再将测序reads比对到这个基因集上，进而进行表达量分析和表达差异分析。
具体而言，我们首先利用Trinity软件对高质量的测序reads进行从头拼接，得到转录本序列，再对转录本进行聚类，挑选最长的转录本作为Unigene。Unigene的序列存放路径：\report\result\1_RNASeq_Pretreat\Assembly
另外，对于Unigene序列，我们使用Transdecoder软件对其进行ORF（开放阅读框）预测，从而得到CDS和蛋白序列，存放路径：\report\result\6_Structure\ORF
3、LncRNA
LncRNA为片段长度大于200nt的长链非编码RNA。分析时，我们用Stringtie软件利用Hisat2的比对结果来组装转录本，在将链方向不确定的转录本去除之后，在剩下的组装转录本集合中进行LncRNA的筛选，获得候选LncRNA。然后我们利用三种软件：PLEK、CNCI、Pfamscan，对这些候选LncRNA进行编码潜能预测，三种软件均判定为没有编码潜能的新转录本是高可信度LncRNA，可用于后续分析。
LncRNA序列存放路径：\report\result\LncRNA\1_Novel_LncRNA
4、CircRNA
CircRNA是一类特殊的非编码RNA分子，与传统的线性RNA（linear RNA，含5’和3’末端）不同，CircRNA分子呈封闭环状结构，其首尾相连的“接头”位置的序列由于来自相隔较远的外显子区域，直接比对基因组时存在大片段的缺口。利用这一特点，我们鉴定CircRNA时首先筛选未比对上参考基因组的测序reads，再截取两端20bp作为Anchors序列再次比对到基因组上，用于检测CircRNA。
CircRNA序列存放路径：\report\result\CircRNA\1_CircRNA_Prediction
5、miRNA
miRNA是一类长度在18-36nt之间的短链非编码RNA，由于其序列较短，我们对它的获取与鉴定是一般是基于一些miRNA数据库，如miRBase进行的。
miRBase (http://www.mirbase.org/）是由曼彻斯特大学的研究人员开发的一个在线的miRNA数据库，该数据库中收录了来自200多个物种、接近4万个miRNA的信息，是最全面的miRNA数据库。
对于被miRBase收录的物种，我们分析时会下载该物种miRNA的前体和成熟体序列，然后将去重后的测序reads与其进行比对，从而对测到的miRNA进行注释。对于这种miRNA测序项目，最简单的获取序列方式就是从miRBase中下载所有物种的miRNA序列，从中搜索目标miRNA的ID即可：
对于未被miRBase收录的物种，我们将去重后的测序reads与数据库中所有动物（或植物）的成熟miRNA序列进行比对，从中筛选保守miRNA。
得到的保守miRNA序列存放路径：\Results\03_Annotation\miRNA
看到这里各位可能已经发现了，无论是哪一种RNA，似乎所有的序列文件都是以.fasta或.fa为后缀的，这是什么格式呢？我们应该用什么软件打开呢？
在生物信息学中，FASTA格式（又称为Pearson格式），是一种基于文本用于表示核苷酸序列或氨基酸序列的格式，可用文本编辑软件打开，如UltraEdit 、EditPlus等软件，系统自带的记事本（txt）工具也可以。然后利用搜索功能查找序列ID，就可以轻松找到对应的序列啦！
Ediplus搜索界面
记事本搜索界面
