2020-09-22
最近有很多老师咨询关于植物性别决定机制研究的项目，今天小编就结合南京林业大学尹老师团队发表在BioRxiv的研究成果（https://doi.org/10.1101/2020.03.15.993022），给大家进行文献解读和该类型项目研究思路的总结。
摘要
植物的性别决定系统和性染色体相对来说在演化史比较“年轻”。本文中，作者发现一个完全雌雄异株的林木美洲黑杨（Populus deltoides）处于性染色体形成的早期阶段，其中雌株和雄株的性别在遗传上分别由两小段与X或Y物理连锁的序列所决定。有趣的是，有两个Y基因在对应的X染色体上丢失了。其中一个基因产生的siRNA通过RNA指导的DNA甲基化和siRNA引导的mRNA剪切来阻断一个对于雌性结构发育至关重要的基因的表达，从而达到抑制雌性结构发育的作用。而另外一个基因能够产生长链非编码RNA（lncRNA）转录本，这些lncRNA转录本在雄性中会消耗一些特异作用于雄蕊发育抑制的miRNAs。拟南芥中的遗传转化试验显示这两个基因能够分布独立并且拮抗地影响雌蕊和雄蕊的发育。因此，杨树中的性别决定系统为开花植物雌雄异株早期演化的研究提供了一个平台，其中两个具有联合效应的性别决定基因比较偏向于紧密连锁。
项目背景
● 性别决定是植物繁殖、发育与进化中的一个有趣的研究方向。大多数开花植物都是“两性同体棵”，只有约10%的被子植物能开单性花（雄花和雌花在同一植株（雌雄同株），或不同植株（雌雄异株））。
● 雌雄异株（dioecism）在被子植物不同支系中独立演化出多次，近年来在芦笋（asparagus；雌性抑制基因SOFF，雄性促进基因aspTDF1）和猕猴桃（kiwifruit；雌性抑制基因SyGI，雄性促进基因FrBy）中的研究显示，该繁育系统由两性同体演化而来，其中Y染色体上完全连锁的两个基因相互独立、却又互相拮抗地作用于雌性和雄性发育。
● 除了双基因系统之外，单基因控制的雌雄异株也存在。在玉米（maize）和甜瓜（melon）中，人为设计出了该系统；而在柿子（persimmon）中则是天然演化出了单基因控制系统，柿子Y染色体上的假基因OGI通过抑制常染色体上的旁系同源基因MeGI来作用于雄花的特化。
实验材料与方法
1、样品选取：
1）Denovo：选取一株雌性P. deltoides及其雄性F2代个体进行从头测序；
2）美洲黑杨GWAS：选取无亲缘关系雌株49， 雄株46；
3）转录组测序：采集9个时期（6月~1月），采集花蕾部分进行转录组测序，每个时期3个重复（其中花药发育早期（T1~T5）,采集的带鳞片花芽，（T5~T9）采集去鳞片花芽）。
2、方法思路：
结果解读
01、性别决定位点的定位和X、Y单倍型的重建
图1美洲黑杨第19号染色体单倍体的重建
本文对一株雌性美洲黑杨以及其雄性子代进行了测序、组装，雌株基因组大小431Mb，contig N50长1.4Mb；雄性基因组大小414Mb，contig N50长2.8Mb。利用SSR标记将性别决定位点定位到了19号染色体上端粒与N362标记之间的299kb基因组区域上，作者将其定义为性别连锁区域（SLR ，sex-linked region）（Fig 1A）。另外，由于雄株是雌株的直系后代，因此雄株XY染色体的X是来自于雌株。作者进一步通过SNP分型，分别构建了雄株的X和Y单倍体（Fig 1B）。通过比较X和Y单倍型的SLR区域，作者发现Y染色体上存在一长一短两个半合子区段，并通过PCR验证了雄性中的半合子区段（Fig 1C、D）。
02、性别决定基因的鉴定
为了进一步的鉴定性别决定基因，作者基于49棵雌株和46棵雄株的SNP数据进行了GWAS分析。
图2 美洲黑杨性别GWAS分析的曼哈顿图
利用雌株基因组作为reference，作者鉴定到了435个SNP存在雌株纯合、雄株杂合的基因型（SEMS），其中315个SEMSs存在于三个SLR基因中，分别是TCP、CLC和MET1（Fig 2A）。剩余的SEMSs中，78个位于一个叫做FERR基因位点上，该位点虽然同在19号染色体上，但是属于拟常染色体（pseudo-autosomal）。至于剩下的那些SEMSs均分布于常染色体上。由于使用的是雌性基因组作为参考序列，可能会将来自Y连锁区域的read比对到X染色体的其它同源区域，从而造成假阳性的SEMS。通过进一步利用SLR-Y作为参考基因组，发现所有常染色体上SEMS全部消除不见（Fig 2C）。另外，采用read coverage，mapping基因组上只在一个性别中存在，而在另一个性别中确实的基因组区域，结果发现以SLR-X作为reference没有鉴定到任何结果，而以SLR-Y作为reference则鉴定到了与之前一致的半合子区段区域（Fig 2D）。而在其中长的半合子区段含有两个基因，分别是FERR-R和MmS。
03、候选性别决定基因的表达
图3 基因表达水平的比较
为了进一步确认上文所鉴定到的候选基因，作者定量了这些基因在杨树雌花和雄花发育过程中的表达水平。结果发现，TCP、CLC和MET1基因在雌、雄花发育过程中均有表达，且没有明显的偏向性。而FERR只在雌花中表达，FERR-R和MmS基因只在雄花中表达。由于FERR基因处于拟常染色体区域，而MmS则处于Y染色体的半合子区域，因此作者推测这两个基因可能作用于杨树的性别决定。
04、FERR-R是一种雌性化抑制基因，产生siRNAs抑制FERR的功能
序列比对显示FERR-R基因与FERR基因序列相似性较高，在启动子和外显子的大部分区域存在序列同源（Fig 4A）。链特异性lncRNA和small RNA测序数据显示，FERR-R基因转录成一条长的转录本，然后会形成小的干扰RNAs，即siRNAs（Fig 4B）。并且由FERR-R基因产生的siRNA可以指导FERR基因启动子、5’-UTR以及第一个外显子和内含子上的DNA甲基化（Fig 4B）。亚硫酸氢盐测序显示FERR基因位点这些区域上的DNA甲基化只是特异性的在雄株中存在（Fig 4B）。此外，FERR-R基因产生的siRNA还能够靶向FERR基因的三个外显子，表明FERR-R基因可能还会参与siRNA引导的FERR基因转录本剪切，作者进一步通过瞬间表达试验验证了这一点（Fig 4C）。结合上文对于FERR基因在雌雄花中的表达分析，以及在拟南芥中的过表达试验（Fig 5A），作者推测FERR基因作用于促进雌性器官发育，而雄株中特有的FERR-R基因则作用于FERR基因功能的抑制。
图4 FERR-R基因起源及及其功能分析
05、MmS基因位点降低miRNA水平，促进雄性
生信分析显示MmS的转录本能够结合多个miRNA（Fig 6A）。qRT显示MmS基因在雄花不同发育时期持续表达（Fig 3C）。作者推测MmS基因通过结合多个miRNAs，从而使得雄株中的miRNAs相比于雌株中的更少，也阻断了雄株中这些miRNA对于其靶基因的抑制，而这些靶基因可能作用于促进雄性器官发育。杨树MmS基因在拟南芥中的过表达试验显示其能够增加拟南芥的雄蕊，但不影响雌蕊的发育（Fig 5B）
图5 转拟南芥的表型
06、性别决定模型推断
综上，作者提出了美洲黑杨中的性别决定模型。结果如下：
结果与讨论
1. 杨树雌雄异型发育过程中可能有许多基因起作用，但FERR-R和MmS似乎是决定杨树雌雄异型的上游基因；
2. 包括哺乳动物、鸟类和果蝇在内的许多Y染色体的一个显著特征是没有交叉，有时会导致出现在X染色体(以及Y染色体祖先)上的大量基因丢失，这一过程被称为基因退化。每周黑杨的性别决定基因似乎也在一个非重组区域，但它在物理上比刚才提到的动物案例要小得多，甚至比猕猴桃和芦笋中的小区域还要小。我们的研究结果揭示了美洲黑杨两个性别决定基因的区域不会重组的原因，同时也说明了有两种不同的途径可以阻止植物Y-和X-连接区域之间的重组。
3. 该研究表明，在杨树中，FERR-R的功能涉及到RNAi和DNA甲基化过程，而MmS是第一个报道在雌雄异株植物中触发性别分离的miRNA海绵基因。由于许多miRNA家族在所有主要植物谱系中进化保守，因此MmS基因可能对杨树以外的植物雄性器官的形成具有重要意义；
4. 在世界上许多地区，杨树是主要的景观，也是重要的纤维和燃料的商业来源。性别决定基因的独立功能使我们可以通过基因编辑分别阻断雌性杨树和雄性杨树的雌蕊和雄蕊发育。本研究为减少有性繁殖的能量消耗，解决雌性杨树的种子毛和雄性杨树的花粉对空气造成的严重污染提供了修饰基因。
该研究不管从实验设计还是结果验证都给了我们对于植物性别决定机制的研究提供了一种很好的思路。如果大家也对植物性别研究有兴趣，欢迎和我们一起探讨，可在文末留言或者邮件交流（genome_support@personalbio.cn）。下面是动植物产品线的产品类型，如果对其他产品比较感兴趣的，也可以邮箱反馈我们，后续我们一一为大家安排
