2020-09-23
前有“代谢组10问10答（基础版）（点击查看）”，后有“代谢组10问10答（进阶版）（点击查看）”，今天我们迎来了第三，希望通过连续三期的问答方式，让更多的人对代谢组研究的了解更深入一步。
Q1、代谢组检测阈值是多少，或者说检测代谢物的最低含量是多少？
不同检测平台的灵敏度是不同的，LC-MS灵敏度最高，可达到fM级。但是，由于不同物质自身的化学性质不同，从而导致质谱的离子化效率、信号响应强度都会有很大的差异。所以，物质在代谢组研究检测中的灵敏度跟自身的性质有关。因此，相同含量的不同物质，可能一个能检测到，另一个检测不到。
Q2、为什么通过其他技术手段检测物质A的含量明显多于物质B，但是在代谢组数据中，物质B的信号强度明显大于物质A的信号强度？
诚如上一题所说，不同物质的理化性质是不同的，各自具有不同的分子结构和性质基团，因此不同物质在质谱离子化效率、信号响应强度等方面都可能是有较大的差异的，最后体现为不同物质的质谱检测效率有所区别。因此，代谢组数据仅适用于同一物质在不同状态、不同组别间的比较，不适用于同一样本内部不同物质之间量的比较。
Q3、实验可收集到的样本量低于检测公司的要求，是否还可以研究代谢组？
代谢组研究在上机检测前，需要对样本进行前处理，进行代谢物提取，如果起始样本量就较少，那么提取后代谢物的量也会很少，上机溶液中每种代谢物的相对丰度则较低，对于质谱检测来说，相对丰度极低的物质则可能检测不到，最终影响到检测到的代谢物数量。但是相对丰度较高的，被成功检测到的代谢物的结果还是有一定参考意义的。
Q4、是否可以专门针对XX物质进行靶向检测？
首先需要对XX物质进行评估，是否具有相关的文献通过质谱平台成功检测该物质，即方法学问题。其次是该类型项目即使文献有相应的方法学，还需去查询是否有可购买的标准品及其货期。待收到标准品后，即可进行方法学试验，此过程可能需要不断地调整参数，优化条件，直至实际的方法学可以检测出标准品完整合格谱图。最后才是检测待测样本。如果需要进行绝对定量，还需使用标准品进行质谱检测构建标准曲线。
Q5、是否可以专门针对XX，YY，ZZ物质进行靶向检测？
除了上述第四个问题的答案中所需要考虑的问题以外，还有一点需要明确，即不同的物质的本身化学性质是不同的，对应的适合扫描模式（正离子扫描模式/负离子扫描模式）可能不同，其次是不同的物质可能存在保留时间接近或者互相干扰影响的情况，导致他们不能在相同的检测条件下同时检测到。所以可根据第一次的结果进一步决定是否需要部分物质单独检测。总体上来说，多次上机分别检测成本比多种物质一次上机检测会有所提高。
Q6、GC-MS检测和固相微萃取GC-MS检测的区别？
GC-MS检测一般是指使用气相色谱仪和质谱仪联用检测代谢物。气相色谱仅适用于沸点低、热稳定性好的小分子物质的分离分析，对沸点高、挥发性低、热稳定性差、极性强甚至极易挥发的物质往往不能直接进样分析。生物样本中含有大量的羟基、胺基、羧基、巯基等官能团的物质信息，因此采用适当的衍生化处理方法对于样品的分离分析往往起着十分重要的作用。样品的衍生化方法的好处有：
1、将一些不适合气相色谱分析的物质进行适当的化学处理转化成相应的挥发性衍生物，可以扩大气相色谱的物质检测范围；
2、改变同分异构化合物的色谱性能，提高和改善样品的峰形和分离度，克服载体、柱壁对高极性、低挥发样品的吸附。甚至通过特殊的衍生方法，分离手性化合物；
3、改善待测物质的热稳定性，以提高检测的灵敏度；
4、改善待测物质的质谱行为，有利于鉴定化合物的结构。
一般GC-MS多用于研究初生代谢物。固相微萃取GC-MS指的是对于样本中的挥发性物质进行萃取后的检测，重点在于检测挥发性物质。主要过程是对顶空瓶中的气体进行抽提的时候采用涂有固定相的熔融石英纤维来进行吸附、富集，然后再解吸，最后打入气相色谱质谱仪器中进行分离分析；从而进行一些挥发性或者气味物质的检测的原理。固相微萃取技术主要用于气体，液体或者固体样本中挥发性组分或者半挥发性组分，气味物质，香味物质的检测。
Q7组织和细胞样本在收集时注意事项的不同？
因为非靶向代谢组测到的代谢物都是相对含量，因此对于检测的样本起始量会要求每个样本是基本一致的。检测公司在接收到项目样本时，对于组织样本，会对每个样本进行称量，取等重量的适量样本进行后续的前处理；而细胞样本，因为细胞样本是离心弃上清后收集细胞沉淀后寄送检测公司，公司实验室收到的细胞沉淀样本，量较少，难以像组织样本那样进行称重，因此需要客户在送样前端就收集等数量的细胞，并注明每个样本的细胞数目，然后进行寄送。
Q8、做代谢组研究每组生物学重复数一定要相同吗？
每组样本的生物学重复数目不一定要相同，但最好不要相差太多，差别不要超过三分之二即可。在一定程度上，生物学重复数足够比生物学重复一样更重要。
Q9、代谢组数据分析完成后，按照VIP>1，P<0.05筛选不到差异代谢物怎么办？
如果利用常用的筛选标准（VIP＞1和P＜0.05）没有找到差异代谢物，首先可以将筛选阈值放宽，如VIP＞1和P＜0. 1。如果还是没有筛选出差异代谢物，那么可以对检测到的物质进行单维统计学分析，如FC>1.5和P＜0.05，通过每单个代谢物组间样本的表达值比较分析差异代谢物，并用火山图展现。
Q10、检测到的代谢物中存在部分物质没有KEGG数据库的ID号是怎么回事？
很多代谢物在KEGG 中没有对应的ID号，属于正常，KEGG并没有把所有的小分子代谢物都囊括进去，因此后续的差异代谢物通路富集分析主要是针对差异代谢物中有对应的KEGG ID的物质进行的。
以上就是我们代谢组10问10答（三）的全部内容，代谢组10问10答为许多老师同学研究代谢组打好了基础，针对代谢组检测完成后如何看懂分析报告，小派也是在之前就整理好了“图说代谢组”报告解读，感兴趣的老师请戳“看不懂代谢组结果？不存在的”，图文并茂，带领大家攻克代谢组报告看不懂的问题。
