2020-10-12
近年来，随着DNA/RNA、蛋白质以及代谢物检测分析技术的迅速发展，以及计算能力的飞速提升，聚焦于微生物组的研究正以指数级的速度迅猛增长。作为目前当红的研究热点，微生物组学可谓“集万千宠爱于一身”，已广泛应用于人体/动物、自然/工业等各种环境体系的微生物群落研究中。
微生物组、微生物群、宏基因组、代谢组……面对一长串令人眼花缭乱的概念术语、研究技术、分析方法，您是不是也会感到困惑，不知从何入手呢？本期的微生物组问答集锦，就将为您答疑解惑，避免混淆和误解，助您快速入门微生物组！
1、微生物组和微生物群，傻傻分不清楚？
微生物组（Microbiome），指生态群落中的全体微生物（细菌、古细菌、低等或高等真核生物和病毒等各种生命体形式）的基因组（基因集合），及其在所处生境内所产生的全部物质信息。这个定义是基于Biome（生物群落）而形成的，囊括了生态环境中的所有生物和非生物因素。
与Microbiome相对的是，Microbiota常用来指代“微生物群”，指的是特定环境中存在的微生物群体的集合。早期有研究使用Microflora来表述“微生物群”的概念，但这一词汇已经不适用于微生物组研究领域，被时代淘汰了。
2、微生物组研究主要使用哪些高通量测序技术？
目前普遍采用二代Illumina和三代PacBio测序技术开展微生物组研究。其中，二代Illumina测序技术根据通量、读长等技术指标，有MiSeq、NovaSeq等测序系统，采用的是双末端（Paired-end，PE）测序，即在待测DNA片段的正反两条链上，各自从5’端开始，测定相同碱基数的序列，目前常见的双末端测序模式有PE150、PE250和PE300（也可表示成2×150、2×250和2×300，150/250/300是指双末端各自测定的碱基数）；而三代PacBio测序则通过单分子实时测序技术（Single molecule real-time sequencing，SMRT），对DNA序列实现单分子级别的超长读长测序，并通过环形一致性测序模式（Circular-consensus sequence，CCS），极大地提高单碱基测序的准确率，因而具有无需PCR扩增富集、超长读长、碱基检测无偏好性和系统性偏差、一致性准确率高、原位实时直接检测DNA修饰等优势。
目前，二代Illumina测序技术可用于多样性组成谱测序（以PE250/PE300测序模式为主）和宏基因组/宏转录组测序（以PE150测序模式为主），而三代PacBio测序技术主要应用于多样性组成谱测序（通量不及二代Illumina测序，但能测定目标基因的全长信息，因而对于优势物种的注释而言更为精准）。
3、什么是16S rRNA基因？ITS序列又是什么？
16S rRNA基因指原核微生物（细菌和古菌）染色体上编码核糖体（Ribosome）RNA的16S（S是沉降系数）小亚基（Subunit）的基因序列。该基因存在于所有原核微生物的基因组中，相当于一个“分子时钟”，序列会随着物种的多样化而发生进化。它既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度可变的序列区域。利用保守区序列设计引物，从而能够将16S rRNA基因片段进行PCR扩增并测序，这样就能根据可变区序列的差异，对不同种属的微生物进行物种鉴定和分类。
细菌/古菌16S rRNA基因常用测序引物及其对应区域
三代PacBio平台和二代Illumina平台的测序模式示意图
ITS序列全称为Internal transcribed spacer，即内转录间隔区序列，是真核生物核糖体RNA（rRNA）基因非转录区的一部分，常用于真菌类群的物种鉴定和群落组成分析。用于真菌物种鉴定的ITS包括ITS1和ITS2两个区域。其中，ITS1位于真核生物18S rRNA基因和5.8S rRNA基因两个亚基之间，ITS2则位于真核生物5.8S rRNA基因和28S rRNA基因两个亚基之间。
真菌ITS及真核生物18S rRNA基因常用测序引物及其对应区域
（https://unite.ut.ee/primers.php）
4、什么是宏基因组学？
宏基因组（Metagenome）是指微生物群落中，全体成员的基因组和遗传信息。而宏基因组学（Metagenomics），就是描述宏基因组特征的方法手段，从中我们可以获得与微生物群落潜在功能相关的信息。通常，我们对微生物组DNA片段化后进行鸟枪法测序，收集所得序列数据并进行序列组装和基因注释，获得群落中各种微生物（包括但不限于：细菌、真菌、病毒等）的基因组序列，从而解析该生态系统下所有微生物的物种分布特征和功能特性信息。因此，宏基因组学研究能全面精细地展示微生物群落整体性的功能代谢谱和物种精细组成谱，从原理上阐明微生物群落在生态系统中发挥作用的根本机制。
5、什么是宏转录组学？
宏转录组学（Metatranscriptomics），的研究对象是微生物组mRNA，通过对特定时间、空间和条件状态下，采集的样本中所有微生物群落的转录本进行大规模高通量测序，可以直接获得样本中可培养和不可培养的各种微生物的转录组及其表达量信息，从而能精确定量整个菌群中具有活性的物种精细组成及其对应功能的表达水平，进而锁定菌群中的关键生物标记物、阐明其生物学意义。因此，宏转录组研究可以检测微生物群落中活性物种的分布特征及其表达转录的功能特性信息，同时可以比较不同时间、空间和条件状态下的差异表达基因和差异功能途径，从而揭示微生物群落在不同环境压力下的调节适应机制，探索“微生物组——环境/宿主”之间的互作机理。
与宏基因组学相比，宏转录组学是在RNA水平研究微生物组的表达谱信息，因而能提供微生物组在环境响应以及表达调控层面的更为真实的数据结果，能有效避免群落中死亡或休眠的微生物的影响，还能避免微生物基因组上未真正发挥作用的基因的干扰。
6、对于微生物组测序研究，生物学重复应该如何设计？
生物学重复的总体设计原则就是：多多益善。一般而言，微生物群落样本总是存在一定的随机性和不均一性，而设置生物学重复将有助于评估样本间差异程度，同时增强结果的可靠性。测序的样本数越多，越能够降低组内样本差异而引入的影响。此外，足够数量的生物学重复，还有助于检测离群样本，因为异常样本的存在，会严重影响检测结果的准确性。在生物学重复数量足够的情况下，通过分析菌群组成、Alpha和Beta多样性指数，可以发现异常样本，将其剔除。
如果样本的类型是动植物相关样本，如肠道内容物或粪便样本、组织样本等，个体间差异较大，建议至少10~20个生物学重复；如果样本的类型是环境样本，如土壤、水体、空气等，建议至少6~8个生物学重复；提高生物学重复的数量可以大大减小生物个体间存在的误差。
7、有生物学重复和无生物学重复，对于微生物组分析有哪些差异？
对于微生物组研究而言，有无重复，判断差异物种或差异基因的统计检验方法是不同的。一般而言，在有生物学重复的情况下，差异的评估是根据重复样本来评估，统计检验的方法更为多样，分析手段更为丰富（如常见的Adonis分析、LEfSe分析、随机森林分析等）；而在无生物学重复的情况下，差异只能通过单独样本的菌群组成丰度或基因丰度来估计，容易产生偏差，分析方法的选择很少。
8、微生物组学研究实验设计，主要有哪些关注点？
一般而言，微生物组研究可以分为横向和纵向两种主要的研究思路。横向研究主要是指多个不同的平行处理之间的相互比较，而纵向研究一般是指多个不同时期/阶段之间的动态变化。在设计实验时，首先需要确定采取的研究思路，当然也可以横向、纵向研究相结合。
此外，微生物组学研究实验设计还应遵循以下原则：
1）取样有代表性。不同类型的微生物群落，其特征差异很大，可能样本采集所需的方式、位置和质量体积都不一样。由于环境条件的变化对微生物生长的影响很大，因此要求不同样本的采集条件、方法保持高度一致，比如对于温湿度、光照条件、取样深度的控制（尤其是多时间分批次收集的样本）。另外，大部分微生物群落的本身分布存在一定的不均一性，需采集合适的样点来尽可能反映样本的总体真实面貌；
2）尽可能排除干扰微生物组检测的潜在影响因素，如人体、动物等群体研究中，混杂的遗传背景、分笼饲养等隐含于实验设计因素外的干扰因素。取样过程中，也要避免发生污染，包括如宿主污染、环境污染等，取样时需要什么，就只取什么。同时，取样所用的工具需经过无菌处理；
3）尽可能多地收集各种影响微生物组的内在/外在因素，比如样本本身的理化特征数据/离子或气体浓度等、人体/动物相关的生化数据、量化的表型数据等，以便与微生物组检测数据进行全面的关联分析，因而这些“元数据（Metadata）”收集得越全面越好，多多益善；
4）不同处理条件的各组样本，包含尽可能多的生物学重复。
9、微生物组学研究流程，一般包括哪些环节？
微生物组学研究流程，主要包括研究设计、实验检测、数据分析和实验验证四大环节。
对于实验测序环节而言，又可细分为：微生物组核酸提取（DNA或RNA）→测序文库制备（对于多样性组成谱测序，需要在PCR扩增后方可构建文库）→上机测序等步骤；
数据分析环节可细分为：数据质控和预处理→注释分析（根据检测方法的不同，可能涉及物种注释、功能注释和代谢注释等）→生态学分析（如Alpha和Beta多样性分析等）→多变量统计分析→标志物识别等步骤；
基于上述研究设计和数据分析结果，可以通过体外实验、无菌动物模型等体内实验、荧光定量qPCR等策略，对候选得到的生物标志物进行进一步的实验验证，以明确特定微生物和宿主、环境之间的互作关系和因果链。
（https://www.nature.com/articles/d42473-020-00214-9）
10、什么是MWAS？
Microbiome-wide association study，即全微生物组关联分析。对于微生物组研究，除了通过测序和差异统计分析来筛选各组样本中的微生物标志物种或基因（Biomarker）的信息外，我们还需要将其它各种检测手段获得的数据，比如代谢组、蛋白组、或检测获得的理化指标、临床指标等各类数据，与微生物组的海量数据进行关联分析，以期找出与各类指标变化相关联的具体微生物物种及其基因。这种研究思路，统称为全微生物组关联分析。
（Zhao, 2013, Nat Rev Microbiol 11, 639-647）
以上就是我们精心整理的微生物组学问答集锦，希望能够成为大家开启微生物组研究的敲门砖！我们后续还将带来更多知识的梳理和分享，敬请期待哦！任何疑问，都欢迎反馈至metasupport@personalbio.cn，我们一定知无不言，言无不尽哦！
