2020-10-15
单细胞转录组测序技术即在单个细胞水平上，对转录组进行高通量测序分析，其让研究人员能够获取之前经常会被大量细胞的RNA-seq方法所掩盖的关键数据，如罕见或新的细胞类型，从而在单细胞水平上探索基因表达多样性。
图1.单细胞测序揭示了被传统的大量细胞RNA-seq方法所掩盖的细胞异质性。
10x Genomics 作为单细胞转录组测序技术主流平台之一，能实现大规模的单细胞转录组测序，具有细胞通量高、细胞捕获率高、项目周期短等优点，并广泛应用于细胞异质性、免疫细胞群体检测及构建细胞图谱等研究。
接下来为大家介绍下10X Genomics单细胞测序的技术原理及样本制备时所需满足的要求。
技术原理
Gel beads及其核酸序列构成
Gel beads，即凝胶微珠。每个凝胶微珠上有40-80万特定的核酸引物序列，该序列由以下几部分构成：Read 1 测序引物、10X Barcode序列（16 nt，一个Gel bead对应一种10X Barcode，共有~350W种10X Barcode，用于区分细胞）、UMI（unique molecular identifier，12 nt，随机序列，区分同一细胞的不同转录本）、poly dT反转录引物（30nt）。
图2.Gel beads构成
微流控技术
如图，在10X Genomics Chromium的8通道的微流体“双十字”交叉系统中，Gel Beads与细胞/酶的混合物在第一个十字交叉口结合，然后在第二个十字交叉口，油将Gel Beads与细胞/酶的混合物包裹起来，形成油包水结构，即GEM（Gel Beads-in-emulsion）。
图3.微流控技术
GEMs形成后，细胞裂解，Gel Beads自动溶解释放大量barcode序列，这些序列与mRNA相结合，随后mRNA逆转录产生cDNA；将得到的cDNA进行纯化、富集，用于后续构建标准测序文库。其中，来自同一细胞的cDNA序列均带有对应凝胶微珠所特有的相同的Barcode标签，并且每个cDNA分子各自还会带有特定的UMI标签。
综上，微流控技术实现了单个细胞的分离；Barcoding技术则区分不同的细胞以及同一细胞中同一基因的不同转录本。
前期单细胞悬液样本制备所需满足要求
1.细胞重悬Buffer
在处理悬浮细胞系、解离组织或大量细胞时，建议对细胞进行彻底的清洗，避免影响后续的细胞回收效率。推荐使用1X PBS（calcium and magnesium free）with 0.04% BSA (400 μg/ml)清洗、重悬细胞。此外，对于敏感的细胞类型，也可选择替代的溶液或者培养基进行细胞清洗及重悬。
Alternative Buffers ：
• Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)
• Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)
Alternative Media ：
• Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM) + 10% FBS
• Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% FBS
• Iscove’s Modified Eagle Medium (IMEM) + 10% FBS
• Roswell Park Memorial Institute (RPMI) + 10% FBS
• Ham’s F12 + 10% FBS
• 1:1 DMEM/F12 +10% FBS
• M199
2.细胞悬液过滤
大的细胞团块、杂质或碎片会增加微流体芯片的堵塞风险，并且干扰准确的细胞计数，从而影响细胞回收。为了避免这一问题，建议使用孔径为30-40μm的细胞筛网对细胞悬液进行过滤；此外，如果悬液中存在大量红细胞，会干扰后续细胞的准确计数，建议使用红细胞裂解液去除红细胞，确保制备的单细胞悬液中无明显杂质，无细胞碎片，无细胞粘连，无红细胞干扰。
3.细胞活性及浓度
在细胞清洗和过滤之后，需测定其细胞活性及浓度，以判断细胞状态并确定上样时的准确体积。推荐使用台盼蓝染色法或者荧光染色法来检测细胞活性；同时可采用细胞计数设备（如血球计数器或自动细胞计数仪）进行定量。
当细胞活性＞80%且浓度介于700-1,200 cells/μl（体积不少于100μl）时，捕获细胞数及基因检出率更容易达到目标值。细胞悬液的浓度一旦超出这个最佳范围，将会导致细胞计数不可靠，建议相应地调整细胞悬液的浓度；而高比例的死细胞可能会影响目标细胞的捕获，并且会释放核酸造成背景噪音，因此对于死细胞比例较高（>20%）的样本，建议使用去死细胞试剂盒/磁珠分选/流式分选的方式降低单细胞悬液中的死细胞比例。
图4.自动细胞计数仪检测细胞活性
4.样本制备后的保存
为了最大限度地减少转录组的变化，在对细胞进行清洗、过滤和检测后，单细胞悬液应当保存于冰上，直至用于后续的上机和文库制备步骤。在理想状况下，一旦制备好样本，应当在30分钟内将其用于下游步骤。
5.特殊细胞类型
由于10X芯片孔径的限制，要求细胞直径＜40 μm；植物细胞需制成原生质体。
