2020-10-21
作为空间转录组的热粉，小派已经带大家进行过入门，文章解读，分析流程解析的学习，今天咱们就来点更实际的，想要开展空间转录组，肯定会遇到各种各样的问题，下面就以Q&A的形式，给大家捋捋咱们的空转小疑惑：
Q1想要做空间转录组，那么什么样本都可以去做空转吗？
A1对于哪些样本可以做空间转录组，可以先参考官方信息，目前，10x 官方已经测试的样本类型如下：
人类：大脑（小脑、大脑皮层、多形性脑胶质母细胞瘤），脊髓（正常），心脏（正常和心肌梗塞），肾脏（正常和肾炎），大肠（结直肠癌），肺（正常，乳头状腺癌）卵巢（肿瘤），乳腺（正常，浸润性导管癌，浸润性小叶癌），脾脏（炎症），淋巴（正常，炎症）等；
小鼠：大脑，心脏，小肠和大肠，胃，肝脏，肾，四头肌，肺，睾丸，甲状腺，胸腺，眼睛，舌头，嗅球，脾脏等；
大鼠：脑，肾，心脏，嗅球等；
斑马鱼：幼体
最新的测试信息可以直接参考官网：https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/tissue-optimization/doc/specificatio ns-visium-spatial-gene-expression-optimized-tissues；
如果咱们的样本不在测试行列内，则需要进行评估。
Q2做空转的组织确定好了，组织准备保存方面有什么要注意的呢？
A2获取新鲜组织后，要对组织进行一定的处理，处理和保存方法如下：
先冷冻后包埋法：新鲜组织样本取下后要迅速用预冷的PBS溶液或生理盐水进行冲洗，去除组织表面残留，然后用干净的吸水纸吸干液体，用预冷的镊子将新鲜组织浸没在异戊烷，组织速冻 1min 或直至组织完全冷冻(实际冷冻时间取决于组织形态及大小)，一旦冷冻，将组织转移到一个预冷的 WHEATON CryoELITE 低温冷冻瓶中，并放置在干冰上。接下来冷冻组织可放置在-80℃下长期保存或立即进行下一步冷冻组织OCT包埋。
包埋和冷冻同时进行法：某些非常柔软的组织（比如胚胎等），失去液体的支撑就会改变其正常形态，对于这样的组织可采取冷冻和包埋同时进行的方法。没有异戊烷的条件下，可以采取包埋和冷冻同时进行的方法。
TIPS
冷冻包埋方法不仅仅局限于上述两种方式，其他方法可以咨询评估，样本质检合格，也可用于尝试进行空间转录组实验（详细的样本准备资料和视频可以联系销售获取）。
Q3直接液氮冻存的样本，保存了很久，可以做空间转录组吗？
A3液氮冻存会在组织表面产生冰晶，冰晶会影响后期切片的组织结构。保存时间久可能会有RNA的降解。这种情况，首先建议如果样本可以重新获得，最好是用预冷的异戊烷包埋重新准备。如果前期收集的样本，后期无法重新获得，则可以将样本进行切片尝试。一般先切10张切片进行RNA质控检验，如果质检合格，可以对切片进行HE染色，染色结果如果显示老师感兴趣的区域组织结构完好，则可以进行后续实验。如果结构破坏严重，则即使RNA质量完好，也无法进行后续实验。
Q4空间转录组对于的组织大小有什么要求吗？
A4空间转录组Visium芯片的捕获面积为6.5mmX6.5mm，所以在选择样本前，首先确 认好最佳的取材位置及合理的组织大小，可以保证Visium芯片的有效利用率。因此对于样本大小，和捕获区域比较合适的最好，大于捕获区域面积的样本，可以考虑放在两个捕获区域。小于捕获区域面积的样本，很难做到一个区域放多个样本，只能试做。
Q5空间转录组对于样本个数有什么限制吗，必须是4个样本的倍数个吗？
A5空间转录组的正式实验，一个玻片有四个捕获区域。一个玻片必须一起操作，所以未满四个样本仍然会消耗一个玻片，所以从成本上考虑，4个样本或者4的倍数个样本是最优的方案。正式实验过程如下：
Q6空间转录组的前期需要进行预透化，会不会预透化的时候找不到最佳条件呢？
A6对于预透化，我们已针对很多个样本进行了测试。样本的最佳透化时间，其实是一个比较长的时间范围，在那个范围内都可以达到很好的mRNA释放的效果。所以一般的组织经过预实验摸索基本都可以找到最佳的透化时间。
Q7那前面说空间转录组最好是四个样本一起做，这四个样本，每个样本都需要单独进行预透化吗？
A7通常情况下，正常样本的最佳透化时间都是差不多的，所以如果四个样本均是正常组织的样本，只是处理略微不同，则可以选择一个样本进行预透化即可；但是对于疾病状态下的样本，最佳透化时间会差异比较大，如果是疾病状态的样本，建议每个样本分别进行预透化实验以摸索每个样本的最佳透化时间。
Q8空间转录组的检测是单细胞层面的吗？
A8空间转录组的检测不是单细胞层面的，官方的Visium芯片，一个玻片上有四个捕获区域，如下图，每个捕获区域面积为6.5mmX6.5mm，每个面积内有5000个spot，每个spot内的细胞数会根据样本类型有所不同，一般是十几个或几十个细胞。所以一般空间转录组文章中空转都会搭配单细胞转录组数据进行联合分析。
Q9空间转录组测序和单细胞转录组测序一起进行的话，每个空转的样本都需要搭配这个样本的单细胞转录组吗？
A9这个按照老师的实验设计来。如果空转的样本来自四个病人，那么建议每个病人做一个单细胞。如果有几个空转的样本来自一个病人的同一个组织，可以这几个样本配一个单细胞。
10空间转录组主要可以应用于哪些领域呢？
10空间转录组研究分析组织的空间位置信息，有助于揭示精确空间范围内发生的信号传导通路和细胞行为，解析目标生物学过程的更深层次的分子机制，多应用于医学相关的研究方向：
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