2020-10-26
2020年即将过去，2021年还会远吗？抓住2020年的小尾巴，蛋白组研究做起来~~~
小派此次整理了蛋白组10问10答——基础版，帮助大家快速入门蛋白组，让蛋白组给自己的科研之路助一臂之力。
Q1. 蛋白组的研究必要性你知道吗？
A1. 蛋白质组(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出，指由细胞或组织表达的所有蛋白质(protein)集合，此处划重点，蛋白组是检测的样本内的累积蛋白量。
基因虽然是遗传信息的源头，而蛋白确实基因功能的执行者
蛋白本身的存在形式和活动规律，如蛋白间的互作、蛋白修饰和蛋白结构等问题，必须从蛋白组的角度研究才能解决
蛋白的变化在临床上往往会作为病理研究的主要对象，同时也可作为疾病诊断的标志物以及对于药物的筛选有重要意义
Q2. 蛋白组研究的常用手段有哪些？
A2. 根据目的的不同，蛋白组研究的常用技术手段也有较大差异。
双向电泳技术（理想目的：将细胞（或组织）内所有蛋白质都分离开来）
质谱技术及一系列派生技术 （测蛋白质序列）
蛋白质互相作用研究：酵母双杂交，细菌双杂交，免疫共沉淀技术，pull-down，FRET,BiFC等
蛋白质定位：荧光标记技术，共聚焦荧光显微镜技术，免疫荧光，免疫化学等技术。
其中，通量最高，结果转化最快，应用范围最广的技术手段要数质谱技术及一系列派生技术，通过质谱平台，可以对样本中的蛋白进行定性和定量分析，明确不同生长条件，不同生理状态，不同样本之间的蛋白表达差异。
Q3. 质谱技术及一系列派生技术包含哪些？
A3. shotgun蛋白定性检测——检测样本中的蛋白质类型，最为基础，入门款；
定量蛋白组检测——揭示样本中蛋白质种类和表达量，进阶款；
修饰蛋白组检测——研究样本中某种修饰类型蛋白质种类和表达量，飞升款；
PRM（目标蛋白定量检测）——对定量蛋白组结果中的目标蛋白进行验证，必须款。
以上是基于质谱平台所做的常见蛋白组研究技术。详情可以点击下方链接，了解每种技术的详情和应用。还没搞清楚蛋白该怎么研究？那是你还没看过这篇总结（点击查看）后面我们的讨论也是针对质谱平台进行蛋白组研究开展讨论
Q4. 哪些样本类型可以基于质谱平台进行蛋白组研究?
A4. 原则上，所有含有蛋白的样本都可以进行蛋白组质谱研究，只是不同样本中的蛋白质量可能不同，对于蛋白量比较低的样本，在做质谱检测之前可能会涉及蛋白浓缩富集的环节。
Q5. 基于质谱平台做蛋白组是否有物种限制？
A5. 基于质谱平台进行蛋白组检测，首先就是要进行蛋白的鉴定，此分析依赖于该物种的参考基因组中的蛋白数据库，一般而言，需要有参考基因组的物种才能进行蛋白组研究，但是如果研究物种暂时没有公开可用的参考基因组，可以使用近源物种的参考基因组或者本物种的转录组数据作为蛋白鉴定所需的数据库。当然，由于物种之间存在差异，最优方法仍是使用本物种的参考基因组进行蛋白鉴定分析。
Q6. 目前蛋白组文章中经常出现ITRAQ和TMT到底是什么？我应该选择哪一个？
A6. ITRAQ（Isobaric tag for relative and absolute quantitation）和TMT（Tandem Mass Tags）是定量蛋白组检测中所用到的、不同生产商所生产的同位素标签，目的是给样本带上标记，方便样本可以进行混合一次上机，避免分批次上机引入的误差。ITRAQ和TMT只是同位素标签的数目不同，可以一次性标记的最多样本数不同。ITRAQ和TMT分别是由美国AB SCIEX和Thermo公司研发，ITRAQ是4标和8标的，TMT是2、6、10、16标的，具体应该使用哪个一个品牌都可以，不需执着于一定要使用哪一品牌。根据文章中出现ITRAQ或TMT，我们只需明确该文章使用了标记定量蛋白组即可。
Q7. 对于标记定量蛋白组，在每个样本带上标签后，会将所有肽段MIX混合后进行色谱分级，其目的是什么？
A7. 通过色谱分级，将所有肽段分离成多个复杂度相对更低的组分，每个组分依次上机，有利于后续质谱检测出更多的物质。
Q8. 进行质谱检测蛋白组的样本应该如何处理、运输和保存？
A8. 细胞、组织、蛋白溶液、菌体等样品最好采用收集后液氮速冻，干冰运输，对于SDS-PAGE条带和2D点以及酶解好的肽段样品直接常温运输即可，如果天气较热，路途较远，也可以进行液氮速冻，干冰运输。
Q9. 哪些样本进行蛋白组研究需要去除高丰度蛋白的去除？
A9. 一般情况下，血清、血浆样品中都会存在高丰度蛋白（白蛋白等免疫蛋白），如果是此类样本，目前人/鼠等物种的血浆/血清样本已有成熟试剂盒去除高丰度蛋白，但某些物种或样本中的高丰度蛋白，如鸡蛋清等样本，尚无成熟方法高丰度蛋白的去除。高丰度蛋白的存在会导致其他蛋白的检测结果。样本是否存在高丰度蛋白可以通过SDS-page胶图或者相关文献明确。
Q10. 为什么有些差异表达基因在蛋白层面没有相应的差异蛋白？
A10. 差异表达的基因，其研究层次是转录组（RNA）层面，差异表达的蛋白，其研究层次是蛋白组（蛋白质）层面，由于转录后调控、翻译水平调控和翻译后水平调控的存在，RNA表达水平和蛋白表达水平结果存在不一致性是一个公认的事实，通常相关性只有～0.5左右，甚至更低。
