2020-11-02
蛋白组10问10答进阶版来啦，一起来看看这次我们准备了哪些问题吧！
1、 如何实现蛋白质定性与相对定量？
提取好的蛋白在上液质联用检测之前，需要先酶解成肽段。定性是通过所有检测到的肽段与蛋白库比对来鉴定蛋白质；定量即提取特异肽段（唯一比对上某个蛋白质的肽段）的峰面积信息处理得到的数据来做相对含量。
2、蛋白组是通过什么平台检测的？
蛋白组是基于LC MS液质联用平台检测的。质谱平台一般包括Thermo Scientific Q Exactive ，AB Sciex Triple TOFTM 5600等。
3、 蛋白组的检测流程具体包含哪些步骤？
4、LCMS检测蛋白原理是什么？
蛋白酶解之后的肽段经过色谱分离之后进入串联质谱。
一级质谱：检测所有带电离子的质荷比和强度，形成一级谱图。一级质谱中的信号为母离子肽段信号。
二级质谱：按照一定方式选择母离子肽段，将其进一步解离，分析所形成的子离子的质荷比和强度，形成二级谱图。
软件对数据库中蛋白进行理论碎裂，得到理论的质谱图，将实际检测结果与理论质谱图进行匹配以鉴定蛋白。
5、 定量蛋白组的检测方法分为哪几种？
常用的蛋白组定量方式分为标记蛋白组与非标记蛋白组两种。关于标记蛋白组与非标记蛋白组的介绍以及对比参见：
a) https://mp.weixin.qq.com/s/szvgexIfJ3O945Q3DS4f8w
b) https://mp.weixin.qq.com/s/5JP1NUtAicPCmqcbhIa2jw
6、 有Co-IP后的样本，蛋白溶液，或者胶条，想看里里面有哪些蛋白选什么方法？
可以选择鸟枪法 (Shotgun)。蛋白质经过酶解生成的肽段经过液相色谱分离后进入质谱分析，通过鉴定蛋白对应的所有肽段来鉴定相应的蛋白，假阳性极低，鉴定结果可靠。
7、 我有一些目标蛋白，想只对目标蛋白定量可以选择什么检测方法?
目标蛋白定量可以选择的常见方法有蛋白质印迹法（即Western Blot）、PRM（平行反应监视，parallel reaction monitoring）、ELISA是酶联免疫吸附测定法。
这三种方法的介绍与对比见：https://mp.weixin.qq.com/s/szvgexIfJ3O945Q3DS4f8w
8、 PRM目标的蛋白定量的建议？
用PRM技术做目标蛋白定量，建议先用混样做个预实验，看样本中都能检测到哪些蛋白，然后从检测到的蛋白列表中挑选关注的蛋白再做正式的实验。
9、蛋白组检测需要多少个生物学重复？
蛋白质组学跟转录组学类似，建议做生物学重复。如果不设重复，并且后期验证实验也较少时，在发表文章时容易被质疑，从而影响文章的发表。如果重复少于3次，那么建议在后期进行大量的验证实验如WB或 ELISA等，以保证数据的可靠性。
对于动植物组织样本，建议5个以上生物学重复。对同一个项目的3-5个生物学重复的样本分别做了相关性检验，提高生物学重复可以大大提高实验结果可信度。
对于细胞样本，由于细胞样本为实验室培养，生物学重复之间的差异性相对较小，建议3个以上生物学重复。
对于临床样品，由于供试者的基因型、生活方式、生活环境、年龄、性别可能存在差异，需要更多的生物学重复，一般要求10个生物学重复以上。
10、定量蛋白组分析内容主要包括哪些？
主要包括肽段和蛋白鉴定，差异蛋白分析（火山图、韦恩图）、差异蛋白聚类分析、GO富集、KEGG Pathway 通路分析、PPI网络分析等。
