2020-11-05
众所周知，文库制备过程中，一般都需要对文库片段进行分选，使得文库片段大小符合预期，然后上机测序，这样才能得到令人满意的测序结果。
下面来简单介绍一下几种常见的文库分选方式
首先是传统的手工切胶回收。它的原理是不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下(如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等)，有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。它的优点是花费的费用比较少。但是切胶回收也有着无法忽略的缺点，比如使用的试剂可能对人体有害；而且实验操作也比较繁琐，耗时长；切胶时回收的片段大小不精确，可能有小分子量污染等。最主要的是普通的切胶回收只能回收中小片段，不能回收三代平台所需的大片段。因此手工切胶回收正在被其他更安全简便的方法替代。
其次是磁珠分选，磁珠分选在二代测序中应用比较广泛。原理是磁珠会优先抓取较大的核酸片段，在分选过程中，通过控制两轮磁珠的加入量来分选到所需要大小的文库片段（如下图）。
而在三代测序中，为了更有效的回收高分子量的目的片段，更多地使用Sage Science （https://sagescience.com/products/bluepippin/）的BluePippin全自动核酸电泳系统。Bluepippin可以帮助三代测序精确去除文库中小分子DNA片段，提升测序数据的有效读长，已经成为三代测序的重要辅助设备。
BluePippin配备了脉冲场电泳，能分辨和收集高分子量DNA。对于长读长的三代测序来说，其中High-Pass过滤程序可以收集大于某一大小阈值的所有片段，这个阈值可以自由设置。只要在软件中输入目标片段的特定长度值或长度值范围，仪器运行结束后就可以从buffer中回收目标片段。每块预制胶最多能运行5个样品（包含一个外参marker），并且不会产生交叉污染。
文库分选操作基本上是仪器自动化进行的，只需几分钟的手工操作，待分选完成以后，即可从收集孔buffer中回收目的片段。
在BioRxiv发表的文章《Highly accurate long-read HiFi sequencing data for five complex genomes》
（https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.05.04.077180v1.full）中科学家就根据需要用了BluePippin和SageELF（后文会介绍）来分选5个不同物种的文库，从而得到符合预期片段大小的HIFI文库，然后上机测序。从最终结果看，HIFI reads的准确性超过99.5%，测序读长范围根据文库大小分布不同为10.5Kb到21.7Kb。
SageELF 也是Sage Science推出的一款全自动电泳系统，可以收集来自单个样本的12个连续组分，SageELF把DNA或蛋白样品按照分子量大小进行区分，随后将整个样品或部分样品划分成12个连续的组分。这个系统同样也配备了脉冲场电泳，可以用于分辨收集大分子量DNA。分隔片段大小的范围由软件自动估算和调整，运行结束后就可以从buffer中回收目标片段。单块预制胶可以运行一个样本，一次运行可处理1块或2块预制胶。
同样在BioRxiv发表的文章《Highly-accurate long-read sequencing improves variant detection and assembly of a human genome》
（https://www.biorxiv.org/content/10.1101/519025v1.full）中，科学家们使用CCS（Circular Consensus Sequencing，环化一致性测序）测序方法进行了人类基因组的测序与组装。根据文章的结果显示，从头测序组装产生了一个连续且高精度的基因组，N50超过15Mb，一致性达到99.998%。识别出的基因组变异 SNVs (99.91%), indels (95.98%), 和结构变异 (95.99%)。几乎所有的变异(99.64%)都被定位到单倍型（haplotypes）染色体上。人类基因组信息的Q30分析，在三代测序仪上达到二代测序仪的测序精度。在该文章的研究工作中，SageELF作为高精度的DNA片段回收仪，实现了对15kb的准确分选和高效回收，表现出优异的可重复性和易用性。
不同文库分选方法其实并无高下之分，根据实际情况，综合实验效率和成本考量，选择合适的文库分选方法，使得最后上机测序结果满足客户要求，就是好的文库分选方法。
