2020-11-09
1、串联质谱的原理？
质谱法(MS)即用电场和磁场将运动的离子，按它们的质荷比分离后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。测出离子准确质量即可确定离子的化合物组成，质谱仪就是用来测定气态离子质荷比（m/z）的仪器。
一级质谱：检测所有带电离子的质荷比和强度，形成一级谱图。一级质谱中的信号为母离子肽段信号。二级质谱：按照一定方式选择母离子肽段，将其进一步解离，分析所形成的子离子的质荷比和强度，形成二级谱图。串联质谱是一种特异性更高，更准确的物质定性与定量技术。
2、DDA 与DIA 技术？
目前流行的蛋白质组学研究手段，如 iTRAQ / TMT、Label-free采用的都是数据依赖性的扫描模式 DDA，二级质谱只能够选择一级质谱中特定数量的肽段分子（如信号强度最强的Top20的离子）进行碎裂，所以说会造成信息遗漏。
与之相对的，就是最近发展的一种新的质谱数据采集方式——DIA。DIA可以依次对特定质量范围内的所有母离子进行碎裂，采集所有母离子的碎片离子信息进行蛋白定性和定量，不会造成低丰度蛋白信息的丢失；对于复杂蛋白样本，特别是低丰度蛋白具有更优异的重现性。
相对于传统的DDA技术，其优势主要体现在：
1样本重复性好
2蛋白质覆盖率、定量准确性高
3通量无上限，适合大规模蛋白定量分析
3、蛋白组学数据库选择？
有参考基因组物种：选用对应物种参考基因组的Protein的注释文件即可，优先推荐使用。
小鼠：https://asia.ensembl.org/Mus musculus/Info/Index
水稻：http://plants.ensembl.org/Oryza_sativa/Info/Index#
无参考基因组物种：
1、可以选择近缘物种的参考基因组作为检索数据库；
2、做无参转录组测序，将转录组测序得到的unigene翻译成蛋白序列作为蛋白质组学分析的理论数据库。
4、什么是蛋白质搜库？
样本经过蛋白质提取、酶解和质谱仪上机检测之后，会产生一系列的谱图。那如何对这些谱图进行鉴定呢？是通过对实验得到的这些质谱图与数据库进行比对，利用软件对质谱图进行自动化的分析，得到肽段序列，通过肽段序列实现蛋白质的定性与定量。
谱图-肽段-蛋白质
5、检索时为什么同一个编号对应了很多蛋白质？
因为一个蛋白家族中常常含有几个或多个同源性很高的蛋白质，这些蛋白质被酶切之后，大概率会产生很多相同的肽段，系统在进行定性分析时，就会将这些肽段均归于得分最高的蛋白质，其他同源蛋白则不计分，而且这些同源蛋白都采用同一编号。
6、什么是修饰蛋白组学？有哪些类型？
修饰蛋白质组学是将修饰蛋白质或肽段富集方法与蛋白质组学相对定量的技术结合起来，不仅可以鉴定翻译后修饰位点，还对不同样本中翻译后修饰的程度进行相对定量，实现大规模的修饰蛋白质组学定性和定量分析，从而进一步揭示某些生理、病理机制。蛋白质翻译后修饰类型多样，常见的有磷酸化、N-糖基化、乙酰化、泛素化、甲基化。
修饰富集
7、蛋白质修饰检测的原理？
蛋白质氨基酸序列的特定位置可以与化学基团或者小分子量的蛋白共价键结合从而发生蛋白质的翻译后修饰（post-translational modifications，PTM），相较于没有发生修饰的蛋白，PTMs会导致特定序列分子量的增加，通过高精度的质谱检测就可以检测到特定的蛋白翻译后修饰。质谱可以分辨蛋白质修饰前后分子量上的变化，因此只要知道靶蛋白翻译后修饰前后的分子量的精确变化，就能对任何翻译后修饰方式进行鉴定和定量。
8、蛋白修饰组学选用技术？
定量磷酸化蛋白质组：iTRAQ、TMT、Label-free；
定量N糖基化蛋白质组、定量泛素化蛋白质组、定量乙酰化蛋白质组以及定量甲基化蛋白质组分析：Label-free（不同类型对应不同抗体）。
修饰组学分析是对发生修饰的蛋白质或肽段进行富集然后上机检测，跟普通蛋白定量组学相比，如果要标记的话样本的需求量会很大，目前修饰蛋白组项目一般labelfree定量会更准确。
9、GO和KEGG注释与功能富集分析区别？
1、GO和KEGG区别：
GO (http://www.geneontology.org/)的全称是 Gene Ontology，从以下三个方面描述生物体中基因和基因产物的属性：细胞组分、分子功能、生物过程。
KEGG 数据库 (http://www.genome.jp/kegg/) 是常用于通路研究的数据库之一，它收录了新陈代谢，遗传信息加工，环境信息加工，细胞过程，生物体系统，人类疾病以及药物开发等多个方面的通路信息。
举一个例子看GO和KEGG注释区别，如某一个蛋白质，GO 只能将它注释到与柠檬酸循环有关；而 KEGG 则可以将它注释到柠檬酸循环通路中的某一个环节。
2、注释与富集分析区别：
但是对于高通量组学来说，了解哪一些功能或生物学途径受到生物学处理的显著影响是首要任务。GO富集分析是指通过Fisher精确检验来评价某个GO功能条目的蛋白质富集度的显著性水平，从而找到所有差异表达蛋白质富集的功能类别。KEGG通路富集分析方法与GO富集分析相似，即以KEGG通路为单位，得到受显著影响的代谢和信号转导途径，这些被显著富集的 GO 条目或通路往往涉及到研究者最为关心的生物学功能。
10、生物学重复和技术重复的区别？
生物学重复是指用同一来源独立制备的样本，或者不同来源的样本（不同的组织，或者一个细胞系的不同培养物）进行相同处理而进行的实验；而技术重复是指同一样品进行的多次相同实验，与生物学重复相比，技术重复的测量变异程度较小。但是技术重复不是完全独立的，取平均值不能去除共有的系统偏差。总的来说，生物学重复用于研究群体的差异，技术重复用于减少这些结论的变异性。
