2020-11-10
Q1：BSA项目有哪些主要的分析方法？
A1：现在运用的最主要的三种分析方法如下：
1、ED值，适用于亲本数据遗失，仅有两个极端混池的BSA项目，也可以用于高杂合度林木类F1代极端混池的BSA项目；
2、snp-index法，该分析的使用必须有亲本的数据，适用于2个亲本和2个极端混池的项目；
3、GPS法，该方法主要针对的是多个混池的项目（一般2~4个混池），有无亲本的数据均可。
Q2：BSA项目的阈值如何设定？
A2：先汇总下BSA主要的阈值选择标准：
1、通过10000（或者1000）次的模拟后选择90%，95%和99%的置信区间的SNP-index值；
2、99%或者95%的分位数，或者所有SNP位点SNP-index 的平均值+3标准差；
3、根据分离群体的遗传分离比确定阈值（如F2代种群分离比为3:1，一般阈值线设定为0.67）；
4、ED算法中的阈值（ED算法阈值众多：有平均值+3X标准差，有ED4＞0.1，也有ED5 的99%分位数等）。
Q3: 测序数据与参考基因组比对率低，可能是什么原因导致的？
A3：1、参考序列质量：参考基因组组装质量差，错误率高，比对率就会低。
2、所测物种与参考基因组的亲缘关系较远，基因组差异较大。这时可将未比对到参考基因组的reads进行局部组装后获得新的参考基因组，再在两个池间比对鉴定变异，进行相关性分析。
3、样品的杂合度高，重复序列多：基因组复杂度较高，比对分析受到的影响也越大。
4、存在外源污染：如个别微小昆虫提取的DNA中，很可能包含植物、共生菌、病原体等的基因组，导致比对率较低。
Q4：某区域测序深度过高会对后续分析产生什么影响？
A4：某区域测序深度过高，可能是存在多拷贝的重复序列，这种情况下检测出的SNP是不可靠的。测序深度提高，覆盖度也会上升，当测序深度达到15X，覆盖度基本上饱和，测序深度达到30X，SNP检测检出率达到饱和。个别区域测序深度过高，会导致SNP检测错误率增加，分析过程中将会删除此类SNP。
Q5: 结果中0/0、1/1、0/1及./.分别代表什么含义？
A5： 这几种均为样品的基因型（genotype）。两个数字中间用“/”分开，这两个数字表示双倍体的sample的基因型。0 表示样品中有ref的allele；1 表示样品中variant的allele。因此：0/0 表示sample中该位点为纯合的，和ref一致；0/1 表示sample中该位点为杂合的，有ref和variant两个基因型；1/1 表示sample中该位点为纯合的，和variant一致。
Q6：定位效果不理想可能是什么原因导致的？
A6：导致定位不理想的因素很多，主要有以下几点：
1、亲本间遗传背景差异大，除了目标性状外，还有很多其他差异，这样对分析产生的干扰很大，难以定位；
2、性状统计复杂，目标性状可能是由多个简单性状构成，可以拆分性状，重新定位，另外数量性状本身也定位难度较高，有一定不可控性；
3、测序数据有污染，可以通过抽取部分测序数据在nr库里做blast比对，检查比对结果；
4、 分析方法不适用，可以分别用ED法和snp-index法进行定位，比较定位结果。
Q7:准确的性状显隐性判定，性状分离比，混池样本数目对分析有什么影响?
A7：群体构建后，一般先统计群体的性状分离比，主要作用是判断该性状是否满足孟德尔遗传定律，是否适用于分析模型并对位点的基因型进行判定；混池样本数目主要是在进行snp-index计算时，是置信区间检验的其中一个参数，混池数目越多，最终模拟得到的阈值线越准确。
Q8：混池数目和测序深度对分析有什么影响？
A8：在《User guide for mapping-by-sequencing in Arabidopsis》中，作者对混池个体数以及测序深度对候选基因数量的影响进行了评估。结果显示，当子代个数超过30个，测序深度大于30X之后，定位出候选基因的数量趋于稳定。同时基于多篇文献的报导，推荐个体数≥30个/池，测序深度：每个亲本≥20X，每个子代池≥30X。
Q9:看分析结果时应该关注哪些信息？
A9：1、定位区间的大小，当定位区间过大时，可以在BSA定位区间内找些SSR、SNP或者InDel标记，进行局部作图，可以有效的缩小定位区间。
2、关注定位区间内snp-index为1的位点，这些位点在两个极端混池中呈现性状关联；
3、关注定位区间内发生非同义突变的位点，氨基酸的突变可能导致所在基因功能的变化；
4、关注定位区间内注释为终止密码子的位点，提前产生终止密码子，可能导致蛋白功能性质的改变；
5、关注定位区间上下游区域的突变，因为候选区间的产生与分析时所选取的各种参数有关，在找不到合适的位点时，可以往候选区间上下游区域进行查找。
Q10：定位不到区间或定位效果差的可能原因有哪些？
A10：1、表型鉴定出现错误或偏差，性状本身由于易受环境影响，导致鉴定不准确，影响混池效果；
2、子代群体数量过少，混池单株数过少，影响最后定位效果；
3、选取的材料性状不够极端，使得最后定位区间较大；
4、没有测亲本序列，直接用研究物种参考基因组，亲缘关系远，出现大量假阳性；
5、研究物种或品系为高杂合，DNA池中存在多种基因型，导致SNP检测和基因型频率计算可靠性降低；
6、研究的数量性状由微效多基因控制，会导致出现多个△SNP-index相似的区间。
