2017-08-23
在类人猿和人类的进化过程中，松弛素基因经过复制，形成了两个序列高度相似松弛素基因，RLN1和RLN2基因。高度同源的RLN1和RLN2基因的同步表达不利于对其进行精准描述。澳大利亚前列腺癌研究中心Colleen Nelson教授研究团队利用Pacbio SMRT和RNA-seq对LNCaP细胞系进行测序，来解析RLN1和RLN2的变异体的表达。文中鉴定了一种新的融合转录本，其中包含有RLN1和RLN2基因，同时发现他们在正常组织和前列腺癌组织中都有表达。融合基因的鉴定提供了用以确定RLN1-RLN2融合基因和RLN1的单拷贝区域的信息。RLN1-RLN2融合基因和RLN1在LNCaP细胞中共表达，但是这两个基因产物被雄激素负调控。这个发现对松弛素领域的研究进行了更新，也激励对RLN1和RLN2在PCa 细胞系中作用的进一步研究。
将环状一致性序列（CCSs）比对到RLN1-RLN2位点，发现CCSs能比对到已注释的RLN1基因，却不能比对到已注释的RLN2基因。两个较长的RLN2转录本的变异体和RLN1基因融合，形成了两个融合基因RLN1-RLN2-1和RLN1-RLN2-2（图1）。
图1 利用SMRT测序识别LNCaP细胞中的RLN1-RLN2融合基因
新RLN1-RLN2融合基因包含RLN1和RLN2的部分核苷酸序列，并获得了基因间区的新外显子。较短的RLN1-RLN2-1融合基因转录为RLN2肽，不考虑对其做深入研究。较长的RLN1-RLN2-2融合基因预测是一个新RLN2异构体，这个融合基因包含有可选择的起始密码子和新的外显子（图2）。新的RLN2异构体包含有完整的RLN2的功能域（B-chain，C-肽和A-chain），但是丢失了整个的信号序列，这对于内质网-高尔基体途径中的分泌过程是必要的。
图2 RLN1-RLN2-2融合编码一个假定的没有信号肽的RLN2异构体。
RLN1-RLN2-2融合基因和已注释的RLN1和RLN2基因有明显的重叠区。利用BLAT工具和USCS基因组浏览器比对新融合基因，在RLN1-RLN2-2单拷贝区域设计qPCR引物。设计RLN1-RLN2-2融合基因的特异性正向引物，需跨越融合的新外显子和下游的融合外显子的结合位点。在RLN2和RLN1-RLN2-2融合基因的共有区域设计反向引物（图3A）。同理设计RLN1的qPCR引物。为了检测引物的特异性，用多四环素诱导的慢病毒载体转染LNCaP细胞系，其编码以注释的RLN2为靶基因的shRNA（shRLN2）。对照是编码非靶基因的shRNA（shNT）LNCaP细胞系。多四环素的处理，对shNT细胞系中RLN1-RLN2-2融合基因的表达没有影响，但是在shRLN2细胞系中引起RLN1-RLN2-2融合基因的显著减少（图3B）。另外，多四环素处理减少了RLN1的表达，但是在shNT和shRLN1细胞系之间没有差异，可以证明RLN1引物的特异性（图3C）。
图3 鉴定识别RLN1-RLN2-2融合和RLN1的单拷贝序列。
RLN1-RLN2-2融合基因和RLN1在转录本的同一链上有重叠区（图1）。预测RLN1和RLN1-RLN2-2融合基因的表达有关联。首先检测RLN1在3个正常组织和7个PCa细胞系中的表达量。发现RLN1只在LNCaP细胞系中大量表达，但是在其他PCa细胞中，表达差异减少了80倍（图4A）。同时发现，RLN1-RLN2-2融合基因在LNCaP细胞系中高表达，在其他PCa细胞系中是低表达（图4B）。利用 GeneAtlas芯片数据分析进一步发现前例腺组织中RLN1特异性表达（图4C）。另外，使用TCGA公共的RNA-seq数据，研究正常组织和PCa组织样本以确认RLN1的表达是否受正常前列腺组织的限制，发现正常组织和PCa组织高表达RLN1（图4D）。
图4 RLN1和RLN1-RLN2-2融合的共表达及PCa细胞系中RLN1表达的不具代表性
用胎牛血清（CSS）代替雄激素培养LNCaP细胞系10天，发现缺少雄激素导致RLN1-RLN2-2融合基因水平保持稳定增长（图5A）。在缺少雄激素的情况下，RLN1的水平也比较高，但是和RLN1-RLN2-2融合基因相比，这种增长是微量的。 为了验证RLN1-RLN2-2融合基因的表达的增加是雄激素导致的，设计了相似的实验。将LNCaP细胞系先在CSS中培养2天，然后用雄激素处理2天。处理后的LNCaP细胞系中限制了RLN1-RLN2-2融合基因表达（图5B）。雄激素处理细胞系和对照相比，雄激素抑制作用导致了RLN1-RLN2-2融合基因水平降低了60-75%。和RLN1-RLN2-2基因相反，雄激素的处理导致RLN1表达上调，表明雄激素对基因的逆调控作用（图5C）。 为了确认RLN1-RLN2-2和RLN1与雄激素的逆调控作用是由于雄激素的信号传导作用，特定地使用多四环素抑制AR，诱导shRNA敲除（shAR）。在多环素诱导和非诱导细胞系中，对照细胞系（shNT）DHT处理抑制RLN1-RLN2-2融合（图5D）。抑制作用在非诱导shAR细胞系中很明显，但是多环素诱导AR敲除改善了这种抑制作用，证明雄性激素信号传导下调RLN1-RLN2-2的水平（图5D）。和RLN1-RLN2-2相反，RLN1的表达在DHT处理的对照细胞系中增加，但是这种增加是受AR敲除的抑制（图5E）。
图5 RLN1-RLN2-2和RLN1受雄激素的负调控作用。
文章目的是通过SMRT平台对PCa LNCaP细胞系中全长RNA转录本进行测序，用以详细解析RLN1，RLN2及它们的转录本变异体的表达，鉴定RLN1和RLN2的单拷贝序列，进而对它们进行更精准的描述。研究发现了一种新的高表达的融合基因，包含有RLN1和RLN2基因，推测编码一个RLN2异构体，导致信号序列区域被改变，可能会改变细胞分泌方式。
参考文献
Tevz G, McGrath S, Demeter R, et al. Identification of a novel fusion transcript between human relaxin-1 (RLN1) and human relaxin-2 (RLN2) in prostate cancer[J]. Molecular and cellular endocrinology, 2016, 420: 159-168.
