2020-11-18
不少初次接触转录组测序的小伙伴，在拿到一份分析结果，并且兴致冲冲地打开差异表达分析的表格后，却被一连串陌生的名词浇灭了科研的热情：foldchange是什么？为什么还有个log2foldchange？Pvalue我认识，那padj又是什么？重要的是，这个basemean到底该怎么理解？报告里说：basemean是DESeq软件对一个组内所有生物学重复的基因表达量做“均一化”结果，可是我拿三个重复的fpkm算了平均数也对不上啊？
莫慌！我们这就用大家都耳熟能详的老朋友——Excel，来演示一下DESeq软件对basemean的计算过程，详细大家在看完这篇软文之后会对basemean有一个清晰的认知。
（温馨提示：文末有“太长不看总结版”）
假设我们获得了一张基因表达量表格，该表格中共有A1-A3，B1-B3共6个样品，1-11编号的11个基因，基因表达量以read count值表示：
1、、对所有read count值取对数，0值仍记为0：
2、计算每个基因在6个样品中的表达量均值（横向计算）
3、用每个基因的表达量减去对应的均值，即2-7列的数据依次减去第8列的数据
4、按样品取中位数
5、因为计算的第一步取了对数，所以现在将中位数利用指数函数转换回去，记为sizefactor
6、回到原始的read count表格，用每一个数值除以对应样品的sizefactor，得到均一化的表达量
7、按照分组方式计算平均数，记为basemean（这里为了展示方便保留了两位小数）
自此我们已经得出了A组与B组每个基因的basemean，接下来通过两个basemean相除，我们就可以得到差异倍数foldchange，再通过负二项分布检验，我们就得到了代表显著性的P值和padj值。这样一张差异表达分析表是不是就初见雏形了呢！
“太长不看总结版”
从DESeq的basemean的计算原理我们可以知道：
NO.1basemean不是通过fpkm计算的，也不是直接求平均数算的，是先用read count除以sizefactor进行均一化，再用均一化之后的read count按分组方式计算平均数。所以我们说basemean是基因表达量的“均一化”结果，而不能直接说是fpkm的平均数。
NO.2“牵一发而动全身”：计算sizefactor时先通过横向（样品）计算Δ值，再通过纵向（基因）找出Δ值的中位数，因此一旦改变任何一个样品或一个基因，所有的sizefactor都会跟着发生变化，也就会导致basemean变化。理解了这一点，我们就可以解决这样的问题了：“A VS C和A VS B两个DESeq表，A组没有变啊，为什么两个表里同一个基因的basemeanA是不同的？”
郑重申明：本文对于basemean的计算仅用于展示软件分析原理，实际结果请以派森诺提供的差异分析结果为准。
