2020-11-19
关于NGS文库质检的事，上次我们聊了文库片段方面 文库知多少——NGS文库质检解析（点击查看），今天我们来聊聊文库浓度方面。
对于illumina 测序平台，准确的文库浓度是获得高质量测序数据的前提，因为：
1、如果上机lane的浓度过低，则导致数据产出少，将不能获得足够的测序数据，需要补测以达到需要的数据量，增加了测序费用和测序周期。
2、如果上机lane的浓度过高，将产生低质量的测序数据，甚至会导致测序失败。
此外，目前主流的illumina测序仪Novaseq 6000每张S4测序芯片可以产出至少3.2T的数据，而单个样品需要的数据量远远小于一张芯片的产出，因此，通常将多个样品混合到一起进行测序，后续再根据每个样品建库时用的index标签来区分；混合到一起的各个样品的产出，理论上与其物质的量占比成正比，举个例子：假设只有A和B两个样品，物质的量各占50%，则产出100G数据时，理论上A有50G，B有50G；当A占90%，B占10%，产出100G数据时，理论上A为90G，B为10G。
由此可看出，准确可靠的文库浓度一方面决定了一张测序芯片的产出，另一方面决定了混合文库中各个子文库的产出。明白了文库浓度检测的重要性，下面我们来聊聊几种常见的文库浓度检测方法。
一、紫外吸收法
紫外吸收法的原理是：核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基都具有共轭双键，在紫外光区的250-280nm处有强烈的光吸收作用，最大吸收值在260nm左右，因此可以利用核酸的紫外吸收性进行浓度定量。
采用紫外吸收法进行浓度定量的常见仪器有NanoDrop分光光度计（如图1），NanoDrop分光光度计操作简便，迅速，但缺点是无法区分DNA、RNA、降解核酸、游离核苷酸及其它杂质，此外，待测样品的浓度小于100ng/ul时，检测结果的变异度增大，可信度不高，因此，该仪器更推荐用于检测提取后的DNA或者RNA的质量，通过比较A260/A280和A260/A230的比值判断提取后核酸的纯度。纯RNA的A260/A280 ≥2.0，DNA的A260/A280 ≥1.8，当样品中杂质含量较高时，比值下降，RNA和DNA的比值分别低于2.0和1.8时，建议纯化除去杂质。
图1
二、荧光染料法
荧光染料法的原理是：荧光染料与特异性的靶分子（DNA、RNA或者蛋白质）结合后发出的荧光强度比未结合前的荧光强度高许多，可以减少游离荧光对背景信号的干扰，且所产生的荧光强度与特异性靶分子的浓度成正比，这样即使在杂质污染条件下，也不会受到干扰，从而得到可靠的浓度。
荧光染料法常用的仪器有Qubit（如图2），通过使用不同的荧光染料，可以特异性地检测双链DNA、RNA或蛋白质，检测灵敏度高且重复性好，双链DNA浓度低至0.5ng/ul也只需1ul即可完成检测。
图2
三、实时荧光定量PCR法（qPCR法）
实时荧光定量PCR技术（qPCR法）是荧光检测技术和PCR技术的结合，在PCR反应体系中加入荧光基团，通过实时监测整个PCR过程中荧光信号的变化情况，反映浓度的变化情况，最后通过已知浓度的标准曲线计算未知样品的浓度。
qPCR仪器主流的品牌有Thermofisher、ROCHE、BIO-RAD。qPCR法涉及到PCR扩增过程，在PCR扩增时特异性的引物仅会定量两端接头连接完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接接头的不可测序文库的干扰，是目前业内进行文库定量推荐的方法。
最后，小编再分享一些个人的经验，由于荧光染料法无法区分单端或双端都不连接接头的不可测序文库，得到的浓度可能偏高，因此qPCR法成为了文库浓度定量最推荐的方法，因为该方法只会检测两端接头连接完整的文库，但是qPCR法也有其局限性，如果文库中有抑制PCR扩增的杂质存在，qPCR法定量得到的浓度会偏低。因此，建议结合两种方法的结果进行判断，选择最准确的文库浓度。
相信不少老师对于浓度检测也存在一些疑惑：为什么各家公司检测的结果差异如此巨大？下面就这个情况小编来分享一些个人的想法。
浓度检测的结果受仪器状态、人员操作、试剂耗材等因素影响，其中仪器状态因素不需过多考虑，重点考虑的因素是人员操作和试剂耗材。检测浓度的移液体积都非常少，约1-5ul，因此非常考验操作人员使用移液器的水平，结果偏离预期较大时，首先应安排重新检测；试剂耗材也是一个重要的影响因素，下面我们以qPCR实验的简化模型作为例子说明，qPCR实验未知样品的浓度是通过已知浓度的标准品计算得出，不同厂商标准品的实际浓度与宣称的有差异，以图3作个简单的说明，假设B厂商标准品B的浓度是真实的10nM，此时待测样品浓度与标准品B对比，可得出待测样品浓度为5nM；但如果我们将待测样品与同样宣称浓度是10nM但实际浓度是5nM的标准品A对比，我们就会得出待测样品浓度为10nM，这样一看，只是标准品不同，结果却相差了2倍。
图3
最后，我们用一个表格来总结3种浓度检测方式吧。
