2020-11-23
导语
单细胞测序=高分文章？在一两年前，大概确实如此。然而到了今天，研究者对此已经越来越心存怀疑。从一个具体的生物学问题出发，准备好精巧的实验设计，加上个性化的分析方案，最终得出推陈出新的结论，已然成为单细胞测序的新方向。
今天，小编以一篇利用单细胞测序技术，解析附肢发育的转录图谱的文章为例，带领大家思考，我们是否能比作者做的更多，做的更好？
脊椎动物的附肢是一个及其复杂的器官，每一块骨和肌肉的位置都被精密地组织在一起。附肢发育的机制研究是一个解析脊椎动物的器官发生分子机制研究的重要范例。作者取了胚胎发育的三个时期，HH25，HH29，HH31的三个样本进行单细胞测序分析。结果显示，在HH25时期，鉴定到间充质干细胞、骨骼祖细胞以及皮肤、肌肉、血液细胞；HH29时期，鉴定到间充质干细胞、远端间充质干细胞、骨骼祖细胞以及指间细胞、非骨骼连接组织、皮肤、肌肉、血液、血管内皮、血管平滑肌细胞；HH31时期因为选取的组织区域较小，因此仅鉴定到间充质干细胞、远端间充质干细胞、骨骼祖细胞以及指间细胞和皮肤细胞。针对不同的细胞类群，分别分析了其特异激活的信号通路以及高表达的marker基因，进一步验证了附肢发育过程中不同的细胞类群。
针对17628个细胞的单细胞测序，作者获得了17828个转录组。利用这些转录组数据，作者进行了WGCNA分析，通过筛选各个共表达基因，获取附肢发育过程关键的候选基因列表。总体而言，WGCNA的共表达genemodule与不同sub-cluster密切相关。比如，HH29的sub-cluster5主要富集了module Green，sub-cluster16主要富集了module Pink。从功能角度看，module Green/sub-cluster5主要与有丝分裂有关，module Pink/sub-cluster16主要与G2/M transition有关，这与t-SNE分布图上两个sub-cluster的空间分布接近是吻合的。以上结果，非常合理，但是读起来，似乎少了一点创新性。
作者将单细胞测序数据与一个已报道的根据不同脚趾以及趾间组织分别取样的bulk RNA测序的结果进行联合分析。在根据bulk RNA测序结果筛选了54个第三趾和第四趾特异表达的基因里，作者关注了7个在第四趾高表达的基因，这7个基因在单细胞测序的结果里，3个是module midnightblue的基因，4个是sub-cluster2的marker基因。据此，作者推断，sub-cluster2是第四趾发育的祖细胞。针对其它的一些module，作者同样地分析了一遍，小编在此不做赘述。
作者针对不同的基因进行了深入分析，但是忽略了细胞间的关系。单细胞测序在发育生物学中的应用，很重要的一个工具是拟时序分析。拟时序分析呈现一系列细胞的拟时间轴上的分布，分析不同细胞之间的演化状态，并能筛选去命运转换过程中特异表达的基因，这些基因可能就是决定细胞命运的关键基因。
根据HH29的t-SNE结果可见，趾间组织主要由sub-cluster2、6、12三个亚群构成。这三个亚群，可被挑选出来进行后续分析。根据bulk RNA测序的结果，可以挑选出在第四趾特异表达的基因，据此可筛选这些表达基因表达的sub-cluster。将依据不同方法筛选的sub-cluster进行拟时序分析，分析这些细胞的演化状态，并筛选出处于中间状态的细胞，解析第四趾的发育轨迹。这些细胞里高表达的基因，则可以作为决定趾的发育的关键候选基因，进行后续研究。
此文的作者非常幸运，之前有报道了他感兴趣的第四趾的特定区域的bulk RNA测序的结果。在实际的研究中，很多工作都没有可供参考的已发表结果。那么，我们又该如何进行科学研究工作呢？以这个case为例，空间转录组测序是一个非常好的解决方案。
空间转录组测序的HE染色图片上，可以轻而易举地筛选感兴趣空间对应的spot，并查阅在这些spot里特异表达的基因。通过分析这些基因在单细胞测序结果里高表达的cluster、，即可判断在感兴趣的区域，聚集了哪些细胞类型。以这些细胞类型作为研究切入点，分析相近的cluster之间的细胞演化关系，以及关键演化状态中的特异表达基因，可筛选到感兴趣组织类型发育相关的关键基因，为后续研究奠定基础。
总结来说，这篇文章描述了发育过程中的不同细胞类型，缺乏明确的生物学问题。样本的设置，无论是时间维度还是生物学重复维度，都太少了。作者获得了17628个转录组，将这些转录组进行了WGCNA的分析，忽略了不同转录组即细胞之间的相关性；而细胞间的相关性，恰是单细胞测序的一个重要解析点。作者虽然筛选了一些基因，但是对这些基因的功能，尚未进行严谨的生物学研究。
科学研究的重中之重，还是生物学问题。如何提出生物学问题，如何解决生物学问题，还是科学研究的重点。派森诺推出多组学整合方案，结合生物学问题，个性化地结合适合的技术手段，为科学研究添砖加瓦。
