2020-12-14
单细胞测序已然成为学术界的新宠，将研究深入到组织内部，解析组织的异质性，不断刷新人们对生命科学研究的认知。单细胞测序通常需要新鲜样本进行实验，这给单细胞测序的应用带来了一定的挑战。不少老师保存了长时间积攒的珍贵的临床样本，如果能够针对这些冻存样本进行深入的异质性研究，无疑具有重大意义。 小编将介绍一系列的如何利用冻存样本进行解析组织异质性研究的高分文章案例，帮助研究者针对性地利用样本资源进行个性化的方案设计。今天，小编就为大家介绍一篇关于单细胞核测序研究冻存样本的文章。 发表杂志：Nature Medicine 影响因子：36.13 发表时间：2020年1月 关键词：脑发育，阿尔兹海默症，TREM2，单细胞核测序 阿尔茨海默病（AD）是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。随着人口老龄化的发展，AD患者数量急剧增加。目前对于阿尔兹海默症的研究，已经深入到多组学水平。前期研究发现小胶质细胞在大脑疾病中发挥重要功能，其主要通过细胞数目、细胞基因表达谱等多水平发挥功能。因此，针对大脑中的小胶质细胞，尤其是其基因表达谱的研究，对于揭示AD发病机制具有重要意义。 作者首先针对野生型小鼠，AD小鼠，Trem2敲除小鼠，以及前两者的双突变小鼠各三只，取大脑组织进行单细胞核测序，捕获到73419个细胞核进行细胞分群分析，共鉴定到10个细胞类群，5种细胞类型。非常值得注意的是，AD小鼠的小胶质细胞的数量大大增加，并且星形胶质细胞数量减少。因此，这两类细胞首当其冲地成为后续研究的重点关注对象。此外，双突变体的细胞数量，与Trem 2-/-突变体以及野生型的数量相近，掩盖了AD小鼠的异常表型，暗示AD产生依赖于TREM2。 为进一步研究机制，作者挑选差异最大的小胶质细胞进一步分析。各基因型小鼠的marker基因分析进一步支持Trem2参与AD产生。此外，将小胶质细胞进一步分群，根据基因表达谱分成4个sub-cluster。有趣的是，AD小鼠中sub-cluster1的细胞数量大大增加，而sub-cluter0的细胞数量大大减少，说明这两个sub-cluster可能与AD产生具有更密切的关系。分析这两个sub-cluster的marker基因，筛选到三个基因，这三个基因可能是参与AD形成的关键基因。 此外，作者对另外一种胶质细胞，少突胶质细胞及其祖细胞进行了分析。少突胶质细胞的细胞数量没有明显差异，因此作者关注在AD小鼠的少突胶质细胞及其祖细胞中特异高表达的基因，关注到了C4b和Serpina3这两个基因，并通过免疫荧光进行实验验证。 随后，作者对AD高风险病例10例，TREM2-CV 11例以及无AD病例11例的脑背外侧前额叶皮质区域，进行单细胞核测序，共捕获到66311个细胞核。同样地，对单细胞核测序结果进行细胞分群、marker基因鉴定、差异表达基因分析及其免疫荧光验证以及针对小胶质细胞重新分群的分析，比较AD小鼠模型和AD病人的基因表达差异。 作者仍然是首先关注细胞数目，发现AD病人中星形胶质细胞数目减少。进一步地挑选星形胶质细胞进行重新分群，marker基因鉴定等分析。针对细胞数目差异不显著的少突胶质细胞，特异的差异表达基因仍然是研究切入点。据此，作者筛选到了影响三类胶质细胞的关键基因，通过对这些基因的功能及所在信号通路的分析，解析AD的发病机制。 此外，作者分析了大样本的bulk RNA-seq分析，筛选到与单细胞测序结果一致的基因。分析了大样本的不同TREM2突变类型的病例，比较两者的基因表达谱，估算的特定细胞类群的数目和信号通路，分析不同类别突变类型影响不同AD进展的分子机制。 总结来说，单细胞核测序与单细胞测序的分析方法、数据呈现方式以及能解决的生物学问题等多方面均没有差别。当我们获得海量的单细胞测序数据后，不妨可以试试像这篇文章的思路，挑选细胞数目存在差异的细胞，挑选已经报道了参与某疾病的细胞，关注这些细胞的差异表达基因，揭示疾病发生机制。并通过大样本的bulk RNAseq测序分析，有望获得疾病类型、不同疾病进展阶段以及不同预后的诊断标记物，为未来的临床诊断提供理论依据。
