2017-08-16
最新一期Clinical Cancer Research (IF: 9.619)上刊登了美国明尼苏达大学研究团队关于前列腺癌肿瘤标志物的最新研究成果，文章题为“Androgen receptor variant AR-V9 is co-expressed with AR-V7 in prostate cancer metastases and predicts abiraterone resistance”。该研究团队采用PacBio全长转录本测序（Iso-Seq）的方法对前列腺癌化疗的抗性标志物——雄激素受体变异体（AR-V）的转录本结构特征进行深入分析。雄激素受体（Androgen receptor，AR）是正常前列腺细胞以及前列腺癌细胞中最主要的转录调节因子。已有研究表明，雄激素受体AR-V7是不依赖配体的转录因子，会促进前列腺癌对AR靶向治疗产生抗性，临床上已将AR-V7作为一种生物标志物，并建立了监测和抑制AR-V7表达的方法。由于受二代测序读长的限制，无法对完整的AR及AR转录本异构体进行准确定量，因此研究人员无法搞清楚是否有其它的AR变异体与AR-V7共同表达，从而促进对AR靶向治疗的抗性。为了解决这个瓶颈，明尼苏达大学的研究团队采用PacBio 单分子测序技术，无需片段化、无需组装，直接对全长转录本进行测序，确定了完整的AR及AR转录本异构体的外显子结构，并估算了它们的丰度。作者发现AR-V7和AR-V9通常在前列腺癌晚期患者中发生共表达，并且还发现，先前认为仅存在于AR-V7中的与可变剪切有关的外显子，同样存在于AR-V9 mRNA中。研究人员重新注释了AR-V9 mRNA的结构，并进一步明确了AR-V9 mRNA的高表达可作为预测前列腺癌对靶向药物醋酸阿比特龙发生抗性的生物标志物。
实验流程：
实验结果
1. AR-V7和AR-V9在前列腺癌细胞共表达
AR典型外显子1-8表达结果和预期的一样，外显子3下游部分高表达，包括CE3和CE5(图1)。AR-V与AR mRNA相比缺少配体结合域(LBD)。
图1 CPRC中AR基因结果
2. AR-V7和AR-V9 3’端外显子结构分析
三代测序完善了AR基因的外显子结构(图3)，此外，不同的引物测序所得的外显子信息完整性不同。
图2 CPRC中不同AR亚型的基因结构
3. AR-V7和AR-V9在CPRC共表达
图3A是56位CPRC阳性病人转移灶活检结果。图3B是12位接受阿比特龙或恩扎鲁胺治疗的病人的肿瘤循环细胞中AR-V7和AR-V9情况。结果表明，AR阳性病人AR调控及前列腺癌相关基因都有一定的表达。部分病人往往存在AR-V7和AR-V9共表达现象。
图3 AR-V7和AR-V9在CPRC共表达
4. 外显子CE3 siRNA抑制AR-V9蛋白表达
图4A显示不同的剪切方式形成了不同的AR变异体，但是AR-V7和AR-V9之间存在overlap。siRNA(CE3或CE5)转染22Rv1和VcaP细胞，提取RNA后进行RT-PCR，图4B结果表明，转染CE3 siRNA细胞的AR-V7和AR-V9表达量都有所降低，而CE5 siRNA只影响了细胞中AR-V9的表达量。转染后细胞的免疫沉淀结果和RT-PCR结果一致。
图4 AR-V7和AR-V9 3’UTR存在overlap
5. AR-V9激活并促进AR合成
慢病毒感染和细胞增殖实验结果表明，AR-V9可促进CPRC细胞的AR非依赖性增殖，也就是说，如果在CPRC的循环肿瘤细胞中检测到了AR-V9的话，那么这可能与患者对Enzalutamide存在耐药性。
图5 AR-V9作为AR的激活转录因子
2016年，派森诺生物在原有的PacBio RS II三代高通量测序仪基础上，率先部署最新款PacBio Sequel测序仪，并已投入使用，助力全长转录组测序研究！
参考文献
Kohli M, Ho Y, Hillman D W, et al. Androgen receptor variant AR-V9 is co-expressed with AR-V7 in prostate cancer metastases and predicts abiraterone resistance[J]. Clinical Cancer Research 2017.
