2020-12-29
免疫细胞针对纷繁复杂的入侵的病原体（抗原）的免疫反应，依赖于其高度多样性的抗原识别受体B细胞表面受体（B cell receptor ,BCR）和T细胞表面受体（TCR）。BCR由四条肽链构成，由两条相同的重链和两条相同的轻链连接而成（重链和轻链分别由不同基因编码），其中重链分为可变区(Variable regions, V区)、恒定区(Constant regions，C区)、跨膜区及胞质区，而轻链则只有V区和C区。TCR是高度多样化的异源二聚体，由大多数T细胞表达的α和β链（αβ TCR）的组成，或由外周血中的T细胞（1-5%）和在粘膜部位发现的T细胞表达的γδ链（γδ TCR）组成。TCR α和δ链的可变区由多个可变的（V）和连接（J）基因编码，而TCR β和γ链由多样性（D）基因编码。
无论是BCR的轻链还是重链，都可以分为可变区（V区）和恒定区（C区），其中V区由2~3个基因片段拼接而成，具有极高的多样性，决定了BCR与抗原的结合能力。轻链的V区由V基因片段和J基因片段构成；重链除上述两者之外，还有一个D基因片段。V、J基因片段在个体胚系基因组上相互远离。但在B细胞内，通过重排，原来相互远离的V和J基因区段接合产生了连续的外显子，其编码整个轻链V区。进一步在转录后，通过RNA剪接将V区外显子连接到C区外显子上，构成完整的轻链mRNA，进一步可以表达为轻链蛋白。将D基因片段连接到J基因片段形成DJ片段，然后一个V基因片段重排至DJ片段，形成一个完整的V区外显子。然后与轻链基因一样，RNA剪接将组装的V区序列连接到邻近的C区序列形成完整的mRNA，进一步可以表达为重链蛋白。
TCRα类似BCR轻链编码基因，含有V和J基因片段（V α和J α）。TCRβ类似BCR重链编码基因，除Vβ和Jβ基因片段外，还含有Dβ片段。同样的，也是经历通过DNA重组和mRNA剪切两个步骤，完成了不同类别的TCR序列的表达。
当病原微生物入侵时，招募不同类别的免疫细胞，不同免疫细胞表达不同的转录组；此外，不同的B细胞和T细胞产生不同的BCR和TCR识别抗原，部分B细胞和T细胞扩增，形成具有相同BCR和TCR序列的多个细胞，该过程成为克隆型扩增。因此，当病原微生物入侵时，体内的免疫状态呈现了多维度的异质性，此时，想要更精细地了解异质性信息，仅关注转录组已经无法满足需求，针对BCR和TCR的VDJ序列的异质性，10Xgenomics公司推出了在cDNA的基础上，进一步进行扩增子测序，通过分析BCR和TCR的不同序列，分析免疫环境中的克隆型多样性，解析有机体抵制病原微生物入侵的免疫机制。
10Xgenomics的单细胞BCR/TCR测序的原理，与单细胞转录组类似，通过微流控系统将带有条形码和引物的凝胶珠与单个细胞包裹在油滴中；接下来在每个油滴内，凝胶珠溶解，细胞裂解释放 mRNA，通过逆转录产生带有 10X barcode 和 UMI 信息的 cDNA。破油（Breaking Emulsions）之后，cDNA 一分为二，后续同时进行基因表达和免疫组库的文库构建。其中 TCR 或者 BCR 的 V(D)J 序列通过设计在 C 区的巢式引物进行 PCR 富集；而 mRNA 的信息，与 10X Genomics 3’mRNA 文库不同，保留的是 5’端的信息。测序后即可一次性获得大量单细胞的基因表达和免疫组库数据。结合转录组测序数据与BCR/TCR多样性数据，解析免疫细胞中更高维度的异质性。
样本要求
1）细胞类型：T细胞、PBMC、 B细胞、肿瘤细胞；
2）细胞来源：血液提取、磁珠富集、流式分选、组织解离、体外扩增、冷冻保存；
3）细胞大小：直径<40 μm；
4）细胞浓度：5×105~1.2×106/ml；
5）细胞活性：>90%；
6）细胞数目：≥ 1×105 cells/sample。
7）保存运输：为了减少运输过程及反复冻融对细胞造成的损伤，派森诺可提供上门服务！
