2021-01-25
单细胞测序联合空间转录组测序，拿到数据以后，到底如何进一步分析，才能发表高分文章？相信这个问题困扰着每一个研究者。
今天，小编解读一篇最新发表于cell的利用单细胞测序和空间转录组测序解析人肠发育的文章。看看大牛是如何分析单细胞测序结果和空间转录组测序结果，如何将两者进行联合分析，运用了什么样的研究思路，采用了什么样的分析方法，解释发育过程中的重要的生物学问题。
作者针对17个胚胎的77个样本进行了单细胞测序，捕获到76592个细胞。这些细胞可以分成内皮，成纤维细胞，上皮，外周血，神经元，肌肉，间充质细胞、肌成纤维细胞和免疫细胞9大类，并对各细胞类型的marker基因进行了分析。这些分析，属于单细胞测序分析的标配。
不同细胞类型的分化和形成，是微环境中细胞外部因子结合到细胞的受体上，完成了外界信号传递入细胞，随后依赖于转录因子的表达和转录调控，完成外界信号到基因表达的级联调控，从而控制细胞的分化和发育。因此，作者对各个细胞类型的转录因子和ligand-receptor关系进行了细致的分析，鉴定了多个决定细胞分化的关键转录因子和细胞间通讯关系。
此外，作者针对5个样本取了8张切片进行空间转录组测序。首先分析在不同空转切片上，分别分布了哪些cluster。结合单细胞测序结果，分析关注的细胞类型在空转切片上的分布，并比较不同区域组织在细胞类型分布上的异同。此外，比较不同切片的相对应区域内的差异表达基因及其这些基因富集的信号通路，揭示该区域内发生的生物学过程以及该生物学过程在不同样本间的差异。
作者随后针对重要的细胞大群进行深入的分析，此处选取上皮细胞进行进一步分析。细胞分群结果显示上皮细胞可以分成15个亚群，这15个亚群在不同部位、不同发育时期是呈现特异性的分布，并通过不同亚群的marker基因对亚群的类别进行判定。随后针对不同亚群的细胞数目进行分析，此处分析不同发育时期不同亚群的数目，结果显示，近端干细胞和远端干细胞随着发育过程细胞数量逐渐增多。那么，在早期干细胞的数目很低的时候，是什么细胞在执行干细胞的功能呢？作者关注到早期细胞数量比较多的是近端上皮干细胞祖细胞。拟时序分析结果显示上皮干细胞祖细胞可发育为上皮细胞。上皮干细胞祖细胞中表达了多个细胞分化的基因，如GATA4,TF,LGR5等，并对这些基因的表达做了免疫组化验证；对上皮干细胞的起源，做了进一步的追溯。
分泌细胞在12周的胚胎中可被检测到，并在之后完成细胞数目的大量扩增，说明其发育从12周开始。此外，通过ligand-receptor的分析，发现内分泌相关的细胞可分泌ligand结合到多种抑制性运动神经元细胞的受体，这个过程也是在12周的胚胎开始进行。以上结果说明分泌细胞的多样性在肠隐窝形成过程中建立。
类似的思路，作者对内皮细胞进行了分群，通过比较不同发育时期的不同类别细胞的细胞数目，发现动脉细胞数目增多，说明在此过程中进行血管发育。针对marker基因的分析，ligand-receptor分析，鉴定ANGPT2是胚胎发育过程中血管形成的关键调控因子。
成纤维细胞可以重新分群为S1,S2,S3,S4四个大群，其中S3在胚胎发育时期的含量特别多，所以作者尤其关注了S3亚群。在拟时序结果中显示，未成熟S3位于细胞演化的关键节点，一部分演化成S3，一部分演化成S1/2/4。进一步地，对S3细胞的ligand-receptor分析显示，S3细胞通过LRP1受体与不同类别细胞进行通讯。在空转的结果上，可见LRP1与其ligand的共表达。
完成了对不同类别细胞的细致分析之后，揭示小肠这个组织的形态建成的调控机制，即分析不同细胞类型之间的协同发育，应该是更具有生物学意义的问题。作者建立了一个形成基因模块分析方法，具体为以已经报道的与发育相关的信号通路为起点，针对单细胞测序的转录组和空转的转录组进行WGCNA分析，那么这些基因所在的基因module以及这些基因module里的基因，可能是参与这些发育过程的基因。
前人报道了S2型成纤维细胞通过表达TGF-β和WNT信号通路的ligand促进上皮细胞的发育。因此，表达了TGF-β和WNT信号通路的S2成纤维细胞成为研究重点。这些细胞中表达了TGF-β通路的BMP2,BMP4和BMP5以及WNT信号通路的WNT5A,WNT5B。那么，这些基因又成为了研究重点。分析这些基因所在的单细胞测序的module（module2）的基因，即共表达基因，筛选到DLL1,BMP5和NRG1。又通过ligand-receptr分析，发现S2成纤维细胞与上皮细胞形成具有较强的细胞间通讯。用类似的方法，作者对免疫细胞和S4成纤维细胞的发育以及病原微生物感染的发育过程进行了详细的阐释，这里不做进一步讨论。
总结而言，分析方法，还是常用的分析方法，如细胞分群，marker基因表达分析，拟时序分析，细胞间通讯分析，WGCNA分析等。关键的问题是，到底关注哪些细胞，关注哪些基因。也就是说，做这些常规分析时，到底挑选哪些数据作为输入文件？这是一个研究过程中的关键问题。科研道路路漫漫其修远兮，只有通过不断地思考生物学问题，提出生物学问题，才能针对生物学问题进行针对性地分析，才能解决生物学问题。
