2021-04-30
与常规的RNA-Seq一样，10x单细胞RNA-Seq/ST-Seq也需要测序数据比对到参考基因组进行基因的定量。那么参考基因组的质量就对单细胞的分析结果有着重大的影响。
接下来小编就给大家介绍一下10x单细胞分析的参考基因组准备。 1、10x官方提供的参考基因组 对于常用的人和小鼠，10x官方提供了经过处理的，可以直接用来定量的参考基因组，可以在下面的链接中下载（https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/software/downloads/latest）。 可以看到人的基因组版本为GRCh38，小鼠的为mm10。都是目前常用的基因组版本，所以如果您研究的是人或者小鼠，那么直接从10x官方下载吧，是不是很方便呢! 2、自建参考基因组 如果您希望使用最新的人/小鼠基因组，或者研究的是其他物种，那么就需要自行构建参考基因组了。单细胞进行基因定量主要分为两步： 1.测序数据与参考基因组比对，获取reads在基因组上的位置； 2.根据reads比对信息和参考基因的位置，对基因进行计数。 所以我们需要准备两个文件，基因组的DNA序列文件（FASTA格式）和基因的注释文件（GTF格式）。常用的Ensembl和NCBI数据库都提供了这两种格式的文件。以Ensembl为例，打开Ensembl（http://asia.ensembl.org/info/data/ftp/index.html）下载页面。 这里我们以人基因组为例，点击相应的FASTA和GTF超链接，可以看到如下页面： 需要注意的是，大部分物种我们需要下载toplevel的序列文件，但是对于人和小鼠这类有单倍型信息的基因组，我们需要下载primary_assembly的序列。将下载好的文件传到linux主机上。 10x单细胞使用的polydT进行RNA逆转录，只能测到带有polyA尾的RNA序列，所以我们需要从GTF文件中过滤掉non-polyA的基因。Cellranger的mkgtf命令可以对GTF文件进行过滤，通过--attribute参数指定需要保留的基因类型： Ensembl和NCBI提供的GTF文件通常都有gene_biotype标签来标记基因的类型。如果从其他来源下载的GTF文件中没有gene_biotype标记，那么就不需要对GTF进行过滤。 处理完GTF文件之后，就可以使用cellranger的mkref命令构建基因组了： 这一步根据基因组的大小，需要的内存和运行时间不同。人的基因组大约有3G个碱基对，小编在构建基因组时，使用了约20G内存，耗时约1.5h。所以建议在大型工作站或者服务器等配置较高的机器上运行。看到如下信息就表示运行顺利完成啦！ 构建好的基因组就可以进行下一步的定量啦！
