2021-08-11
ChIP-Seq相信很多老师已经很熟悉了，然而在做ChIP-Seq实验时，甲醛交联的效果，抗体的选择，超声的效果等因素都很大地影响了实验的成功率，您是否也在为此苦恼呢？下面派森诺生物就带大家了解一下ChIP-Seq的“升级版”- CUT&Tag，相较于传统的ChIP-Seq， CUT&Tag将繁复的ChIP-Seq变成更为便捷简单的操作，为研究DNA-蛋白质相互作用提供了更为有效的工具。
1.CUT&Tag 是什么？
CUT&Tag 是蛋白质-DNA 互作关系研究的新方法，能在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA片段，是新一代超微量ChIP-Seq技术，适用于无ChIP级别抗体的蛋白研究。CUT&Tag 有望将蛋白与染色质 DNA 互作的研究变成了一种类似 PCR 反应的常规操作，对基因调控、表观遗传等领域的研究具有重要的意义。
2.CUT&Tag的流程？
① 收集细胞；
②分别孵育一抗和二抗；
③孵育pA/pG-Tn5转座子（HyperactivepA/pG-Tn5 Transposon）；
④激活转座子，进行DNA片段化；
⑤DNA提取；
⑥文库扩增与纯化。
3.CUT&Tag 技术的基本原理？
在抗体引导下，ChiTag 酶仅在目的组蛋白修饰标志、或转录因子、或染色质调控蛋白结合染色质的局部进行目的 DNA 的片段化的同时添加测序接头，并释放到细胞外，而绝大部分无关的染色质还留在细胞核内，因而整个实验的信噪比大幅提高，同时简化建库操作，实现了低细胞量样本研究组蛋白修饰和转录因子的目标。
4. CUT&Tag技术优势？
①样品起始量低
②无需提供ChIP级别抗体
③实验操作简便，周期短
④背景噪音低，信噪比高
⑤实验重复性好
5. CUT&Tag适用于什么物种？
CUT&Tag适用于哺乳动物细胞的蛋白-DNA互作研究，酵母、植物等细胞需要经过(破除细胞壁或者提取细胞核)来进行实验。CUT&Tag在哺乳动物细胞系上的应用比较成熟，动物组织经过处理得到悬浮单个细胞同样可以进行实验。
6. CUT&Tag的送样要求？
样本类型：细胞样本、动物组织、DNA 文库样本
送样要求：
细胞量：组蛋⽩≥40万，转录因⼦≥100万；复苏后细胞活率 ≥ 85% ；WB 2m
动物组织：转录因子 ≥200mg；组蛋白 ≥100mg ；WB≥50mg
DNA文库：总体积≥25ul，浓度≥2ng/ul，总量≥50ng，提供P7和P5的 index
7. 做CUT&Tag实验的时候，阴性对照和阳性对照怎么设置，作用是什么?
与 ChIP 不同，该实验方案不需要 input 样本，但需要添加阴性对照和阳性对照。针对抗体的阳性对照可以采用RNA Pol II/ 组蛋白，证明系统没有问题。阴性对照使用与一抗相同种属的IgG，阳性对照，阴性对照证明抗体特异，实验结果可信。
8. CUT&Tag 与 ChIP-Seq流程比较？
9. CUT&Tag和ChIP-seq，该如何选择？
· 植物以外的物种，无论是组织样本还是细胞样本，推荐CUT&Tag ，相对来说CUT&Tag具有更高的成功率和信噪比；
· 植物样本，推荐ChIP-seq。植物样本提核困难，不适合CUT&Tag。
10. CUT&Tag技术应用？
· 应用于表观遗传学领域的蛋白质与DNA互作研究
· 研究转录因子在全基因组上的结合或分布位点
· 研究组蛋白修饰在全基因组上的分布位点
· 研究转录因子下游调控的靶基因
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