2017-07-12
SMRT（Single Molecule, Real-Time）测序，即单分子实时测序，该方法基于纳米小孔的单分子读取技术，无需扩增即可快速完成序列读取。Pacific Biosciences自2013年成功推出商业化的三代测序仪PacBio RSII后，三代测序开始被广泛应用于基因组学、转录组学研究中。三代测序技术通过其独有的环形一致性测序模式（Circular-consensus sequence，CCS），极大提高单碱基测序的准确率，远超Illumina等二代测序技术。与传统转录组测序项目相比，利用PacBio平台的全长转录组测序技术可以直接获得mRNA的全长，保证了mRNA序列的精确性。
2016年6月，南开大学发表题为PacBio full-length transcriptome profiling of insect mitochondrial gene expression的文章，以黄斑蝽线粒体为研究对象，通过全长转录组测序，揭示线粒体基因转录、RNA加工、mRNA成熟过程及rRNA结构，并优化和提升了基因组的注释。
1 研究目的
第三代测序技术与二代测序技术在读长上有明显优势。期望利用三代测序技术的优势提升昆虫线粒体基因组注释信息并获取cDNA的全长；另一方面，建立一个新方法，用以研究线粒体基因转录、RNA加工、mRNA成熟及rRNA结构研究等科学问题。
2 研究方法
取黄斑蝽雌体和雄体各一只进行混样，提取总RNA后，利用SMARScribe试剂盒将mRNA进行反转录获得cDNA，构建好的文库用PacBio平台进行测序。
3 分析结果
1) 线粒体转录组图谱.
黄斑蝽基因组调到J(+)链，组装转录本在J(+)链用红色表示，N(-)链用蓝色表示，绿色代表tRNA的氨基酸。
2) mRNA和rRNA成熟
成熟的线粒体mRNA和rRNA都具有3’ployA尾结构。具体结构见下图，TIS代表转录起始位点，m7G代表7-甲基鸟苷帽子。
3) 多顺反子转录本、RNA前体和RNA加工
以ND3和 COII多顺反子转录本为支撑，tRNA为结尾的剪切方式称为“反式剪切”模型，以mRNA和rRNA为结尾的剪切方式称为“正向剪切”模型。
本全文作者发现线粒体rRNA存在3’多聚腺苷酸化，5’存在m7G，12S rRNA的isoforms存在多样性；同时发现线粒体基因的多顺反子转录本和自然反义转录本。
4 参考文献
Gao S, Ren Y, Sun Y, et al. PacBio full-length transcriptome profiling of insect mitochondrial gene expression[J]. Rna Biology, 2016, 13(9):820.
2016年，派森诺生物在原有的PacBio RS II三代高通量测序仪基础上，率先部署最新款PacBio Sequel测序仪，并已投入使用，助力全长转录组测序研究！
