2022-03-17
NGS测序中的常规类文库主要针对全基因组测序，广泛应用于各类物种的重测序、遗传变异检测、BSA性状定位、遗传图谱构建、群体进化、全基因组关联分析、质粒&线粒体&叶绿体测序、宏基因组测序、小片段测序等领域。NGS测序涉及提取、建库、上机多个环节，每一步都会影响最终的数据质量。很多老师在收到质检报告后，对于DNA质量的判定存在疑惑。因此，小编梳理了整个建库环节中DNA质量对后续影响的问答，帮助老师更好的理解DNA与建库结果的关系。
Q1、常规类文库的建库流程。
根据不同实验要求，各步骤相应调整，整体流程如下：
片段化→纯化→末端修复&末端加dA→连接接头→纯化→片段分选→扩增→纯化→定量→库检
Q2、影响建库成功率的因素有哪些？
主要是DNA的浓度、总量、纯度、完整度等。常规类文库一次建库需要投入200ng的DNA。如果纯度较差或总量不足，就可能会使最终文库的浓度不满足上机要求。
Q3、DNA主带很清晰，并且没有降解，为什么还会有100bp的小片断核酸？
提取过程中未去除彻底的降解或游离的DNA、RNA小片段核酸。
图一 2号样品小片段核酸严重
Q4、100bp处的小片段核酸会影响后面的建库上机吗？需要额外纯化吗？
对于常规文库而言，如果DNA主带完整，降解程度不高，不需要额外的纯化，少量小片段核酸会再后续建库过程中被纯化掉。对于一些特殊文库，小片段核酸可能会有一定的影响，建议去除。
如果小片段核酸残留特别严重，DNA的实际浓度会与测定浓度偏差较大，造成投入量不准确，且后续建库过程中很难将这些小片段核酸完全纯化掉，影响文库的后续质量，进而影响测序数据的质量。
Q5、DNA的纯度会对建库上机有什么影响。
DNA提取原样中的多糖多酚、次生代谢物、各种矿物质或有机物质，都会造成DNA中含有各种杂质。DNA中存在这些杂质就会影响建库过程中的酶促反应、文库定量的准确性、下机数据的质量，导致文库建库失败或最终下机数据不理想。这就是为什么如果样品杂质含量高的情况下会建议先纯化再建库的原因。
图二1-4号样品胶孔杂质严重
Q6、DNA样品中存在RNA污染，会影响建库吗？
如果样品中存在RNA污染，建议老师做RNA降解的处理。一方面，这会影响实际DNA的浓度；另一方面，可能会有部分RNA被连上接头并最终测序。这样会导致下机数据不理想或在过滤数据的时候造成浪费。
图三 1-6号样品存在RNA污染
Q7、DNA的降解对建库上机有什么影响？
如果在样品获取、保存、提取过程中处理不当可能会使最终得到的DNA存在一定程度的降解。如果DNA存在降解，主要在于样品的采集方式、保存环境不当，样品经过反复冻融；也可能是被细胞中自身存在的的酶降解。这种降解常带有序列偏好性，会对后续的下机数据分析（比如序列拼接等环节）产生不同程度的影响。
图四1-3号样品严重降解
Q8、一次建库需要多少总量的DNA，最低总量多少成功率较高？
不同文库的建库起始量不同，常规PE文库、Metagenome文库一次建库起始量要求200ng以上。很多时候由于样品珍贵，导致实际建库过程中无法满足正常起始量的要求，也可以采取风险建库的方式建库，通常判断等级为C等级的样品总量虽然不满足正常一次建库要求但建库成功率高。
Q9、样品来源珍贵，总量较少，很难达到常规建库要求怎么办？
很多受到来源的限制的样品DNA总量非常低，推荐构建微量基因组文库（可以参考“微量基因组建库方案介绍”，最终数据结果和常规文库是基本一致的）。微量基因组文库的建库起始量最低要求为5ng（浓度大于0.5ng/ul，DNA条带清晰）。小于该总量或电泳检测结果中无法识别到DNA条带的样品可以风险建库。根据以往建库结果判断，如果样品中确实有提取到的DNA，成功率很高。
综合上述相关问题，可以发现在NGS测序环节中，DNA的质量会从多方面影响最终建库成功率、下机数据的质量。这要求对不同物种、不同来源的样品选择最适合的方法，从而提取到质量最佳的DNA。同时派森诺提取方法也在不断进行优化中，积累了非常多的项目经验，在许多困难样本中都能获得质量合格满足上机要求的样品。
图五 植物--农业作物、蔷薇科、杜鹃科等
图六 临床样本--癌组织、血液、细胞
图七 动物组织--鱼类、昆虫
图八 细菌/真菌/黏菌
图九 宏基因组样本--粪便、土壤、发酵物
另一方面，对于来源珍贵或提取极为困难的样品，单纯从提取方法上很难得到质量完全合格的DNA样品。针对这部分样品，需要根据实际DNA的状态，优化建库实验方法，尽可能的将这部分样品建库成功，并得到高质量的测序数据。微量基因组就是为了满足这类样品不断优化的一个建库方案，这套方案已经在非常多的项目中成功建库，详细比对数据可以参考之前公众号介绍（微量基因组建库方案介绍）。
派森诺多年来积累了丰富的项目经验，根据不同的物种、组织部位、保存环境，可以给老师提供全面、优质、高效的NGS测序支持。
