2022-05-12
时至今日，空间转录组已经取得了极大的研究成果，无论是10X空间转录组还是BGI的Stereo-seq，在研究组织发育图谱和疾病方面都起到了非常重要的作用。但是其中有一个值得深思的小缺陷，那就是整个空间转录组在免疫组库方面的研究乏善可陈，一方面是由于空间转录组测到的是3’区域，而VDJ的变体结构富集在5’，另一方面VDJ在一个免疫细胞中通常成对出现，而空间转录组的精度目前均没有细胞级，10X空间转录组的精度为55um，而Stereo-seq是纳米级精度，所以无法像单细胞一样检测到VDJ pairs。尽管如此，还是有文章和方法可以解决这个问题，我们来看看空间转录组免疫组库的运用和方法。
应用一：肾细胞癌空间转录组BCR的检测运用
在文章Tertiary lymphoid structures generate and propagate anti-tumor antibody-producing plasma cells in renal cell cancer[1]中，发现肾细胞癌三级淋巴结构（TLS）中B细胞成熟亚型和浆细胞的共定位暗示了原位 B 细胞适应性免疫的产生。在此过程中，B 细胞会突变其 B 细胞受体 (BCR) 序列，并选择和扩增最亲和的克隆。为了证明这些事件，有必要研究 BCR 的核苷酸序列。10X Visium 空间技术基于条形码转录本的 RNA 测序，这能够保留原始转录本并执行空间 BCR repertoire 分析，在足够长度的 mRNA 转录物捕获大多数 IGL 和一些 IGH 序列的完整互补决定区 (CDR)3 区域。在包含TLS区域的肿瘤中发现了最多的独特克隆型和总 Ig 计数。在 TLS 区域也发现了数量最多的独特链克隆型。通过测量 Ig 轻链序列的 V 区的突变计数与映射的 V 种系基因进行比较来评估 B 细胞成熟。并且值得关注的是，在肿瘤区域中远离 TLS 的大部分是高度突变的序列。尽管如此，在 TLS 区域研究了全部的突变序列，包括高度突变的序列，而距 TLS 一定距离的大多数 Ig 转录物富含高度突变的序列，表明体细胞超突变发生在 TLS 中，并表明突变的 PC 在整个肿瘤中迁移。
图1 每个spot的独特 IGL 克隆型平均数量和平均 VL 突变计数的空间分布
为了确定扩增的 IgH 克隆型的克隆关系和位置，对 30 个 RNA-seq 空间数据进行了克隆性评估。克隆性由相同的 VH 基因家族、相同的 JH 基因和相同的 CDR3 长度以及 VH 序列之间的 CDR3 核苷酸序列的最大差异为 15% 来定义。为了可视化这些关系，计算了每个 VH CDR3 序列之间的 Levenshtein 距离，并用 TLS+ 肿瘤的圆形树表示它。IgH 克隆型在 Visium slide 上的定位证明了同一家族的克隆型聚集在 TLS 附近并在远处稀疏迁移。一些克隆型甚至可以在距它们所在的 TLS 区域高达 3 mm 处检测到可能已经生成。此外，这些克隆型位于 TLS 内部和远离 TLS 的位置，表明相应 B 细胞克隆的迁移。
图2 IGH克隆型的聚类分析与空间定位
应用二、癌症空间转录组TCR的检测运用
空间转录组学允许在不影响空间信息的情况下测量基因表达，从而判断细胞的空间分布与相互作用，其中，免疫细胞与肿瘤细胞的相互作用显得尤为重要，对适应性免疫过程的详细了解需要确定 B 和 T 细胞受体序列，这些序列决定了淋巴细胞抗原的特异性，并可以作为淋巴细胞克隆的条形码。抗原受体测序已经改变了 B 和 T 细胞的单细胞研究，于是在文章Localization of T cell clonotypes using spatial transcriptomics[2]中提出了一种从 10X Genomics 的商用 Visium 空间基因表达平台确定 T 细胞受体 (TCR) 序列的方法。技术允许同时可视化 T 细胞受体克隆型和组织内的整体基因表达。
图3 TRB序列的空间分布
借助空间TCR克隆的空间分布研究，可揭示浸润肿瘤组织的免疫细胞的VDJ pairs，意义重大，甚至可指导临床运用，如果通过体外培养具有浸润肿瘤的免疫细胞（拥有超突变的VDJ pairs）作为靶向治疗，相信可以攻克肿瘤难关。
空间VDJ检测的分析原理
下图为空间VDJ文库构建示意图：
图4 空间VDJ文库构建示意图
最为核心的部位就是类似于单细胞进行5’VDJ区域的富集，从而达到空间检测CDJ的目的。Visium 空间转录组学平台使用载玻片结合的单链 DNA 探针来捕获多腺苷酸化的 mRNA。每个探针在 5' 端包含部分 Read 1 序列、16 个核苷酸的空间条形码、12 个核苷酸的唯一分子标识符 (UMI) 和 3' poly(dT) 尾。最初使用 read 1 引物序列对于 cDNA 扩增，空间条形码将探针连接到特定的空间位置，UMI 识别第一链合成过程中产生的独特 cDNA 分子。在成像和组织透化后，多腺苷酸化的 RNA 分子与 poly(dT) 尾部退火，允许随后的逆转录以扩展 ssDNA 探针以包含 cDNA 序列和添加的模板转换序列。第二条链是用与模板转换序列互补的引物产生的；通过添加氢氧化钾从载玻片上洗脱这条全长的第二条链。该洗脱的第二条链被扩增以生成全长 cDNA 文库，该文库具有空间条形码和 UMI，位于 poly(A) 尾的 3' 端。
为了生成包含 TCRβ 的 CDR3 区域以及 UMI 和包含位置信息的空间条形码的 cDNA 分子，TCRβ 扩增必须在 TCR 的 5' 端使用引物进行。由于 TCRβ 恒定区位于 CDR3 的 3' 端，因此需要一组可变 (TRBV) 基因引物来生成包含 CDR3 和空间信息的 cDNA 分子。使用来自 Visium 测定的扩增 cDNA 作为模板，使用该修饰的 TRBV 引物池和 Read 1 引物进行 PCR，以生成富含 TCR 的文库。虽然标准的 Visium 基因表达方案要求对 cDNA 文库进行片段化，但 此处生成的富含 TCR 的库不能在不丢失 TCR 和空间条形码序列之间的联系的情况下进行分段。因此，富含 TCR 的 cDNA 文库通过珠子纯化进行纯化，并直接进行样本index PCR 以进行双端测序。
双端测序的read 1 必须执行至少 28 个PCR循环，以提供 16 核苷酸空间条形码和 12 核苷酸 UMI 的序列。read 2 包含 TCRβ 识别 CDR3 序列，最好长于 100 个核苷酸。在当前的研究中，在 Illumina MiSeq 仪器上进行了读取长度≥150 个核苷酸的双端测序。为了分析，read 2 经受 MiXCR pipeline以识别存在的 TCR 和支持每个识别的 TCR 序列的read。从配对read 1 中识别出 UMI 和空间条形码，以校正扩增偏差并将 TCR 与空间位置匹配。
空间VDJ的重要意义
空间VDJ的研究绝不仅仅是提供了VDJ序列在空间上的分布位置，更多的是在不同的空间条件下，VDJ分布蕴含的重要生物学意义。B细胞IGH超突变的迁移和浸润，为癌症的免疫治疗提供了新的契机，也充分认识到免疫细胞的迁移之伴随着其他细胞类型的辅助完成的。T细胞VDJ序列的空间分布，尤其浸润肿瘤组织的对肿瘤细胞的杀伤作用，对临床研究有重大意义。总之，空间免疫组库是一个全新的技术领域，未来一定会在生物学研究、临床应用方面发挥巨大的作用。
[1]Maxime Meylan, Florent Petitprez, et al. Tertiary lymphoid structures generate and propagate anti-tumor antibody-producing plasma cells in renal cell cancer. Immunity. 55, 1–15.
[2]WH Hudson，LJ Sudmeier,et al. Localization of T cell clonotypes using spatial transcriptomics.biorxiv
