2022-07-28
转眼到了2022年的下半年，各位奋战在科研实验，埋首期刊文献中的小伙伴可有收获？
最近一直收到很多老师同学的咨询，跟随单细胞的大潮测了不少单细胞样本，在拿到数据之后不知道做哪些挖掘可以解决自己想要说明的问题。
本章专题将结合文献和大家分享单细胞中的那些分析以及结果的阐述。
在进行接下来的介绍之前，我们假定您已经拥有细胞分群已经细胞亚群定义的结果。
一：单细胞轨迹研究
在进行细胞动态发育，或者细胞状态分化过程中，使用轨迹分析可以获得细胞发育的方向以及状态。同时也有助于获得处于中间态的细胞类型。
迄今为止，单细胞轨迹研究方法的研究论文已有很多。常见的有monocle拟时序分析、RNA velocity细胞速率、Palantir拟时序分析、CytoTRACE细胞分化潜能、PAGA轨迹推断等。
接下来我们给大家分享一下这些方法的应用实例：
2017年发表于《Cell》上的《Landscape of infiltrating T cells in liver cancer revealed by single-cell sequencing》使用monocle2对CD8+T细胞和CD4+T辅助细胞进行了拟时序分析，结合TCR共同验证解释了CD8+T 从C1_CD8-LEF1细胞(naïve CD8+T细胞)，其次是C2_CD8-CX3CR1(效应记忆CD8+T细胞)到C5_CD8-GZMK，最终是到C4_CD8-LAYN细胞（耗竭T细胞）的转变，基于这种轨迹分析，作者发现C5_CD8-GZMK似乎是效应T细胞和耗竭T细胞之间的中间状态。
接下来作者分析了CD4+T辅助细胞来确定分化轨迹。根据拟时序的结果，C6_CD4-CCR7幼稚T细胞和C9_CD4-GZMA T辅助细胞主要聚集在伪时序的主干上。C10_CD4-CXCL13(耗竭CD4+T细胞)和C11_CD4-GNLY(细胞毒性CD4+T细胞)细胞在伪时序轨迹图中位于不同的方向，表明这些细胞在功能上存在差异。
2020年发表于《Cell》上的《Molecular Pathways of Colon Inflammation Induced by Cancer Immunotherapy》使用细胞速率分析解析了在揭示了从Trm向细胞毒性效应细胞的潜在分化轨迹，这也就解释了在+CPI colitis 样本中，部分增殖T细胞与毒性T细胞的产生是由Trm细胞的直接分化导致，解释说明了免疫治疗早期就能在病人肠道中观察到炎性症状的原因。
二：基因集分析
基因集分析在肿瘤样本的分析中也是十分常见的的手段，基于感兴趣的基因集使用不同的打分方法来对细胞进行评分，可以比较直观的定位到自己关注的通路是否存在差异。
如今的基因集分析的方法也是多种多样，GSVA、AUCELL、AddModuleScore、GSEA等较为常见，接下来我们来分享一些这些方法的应用:
2020年发表在《Nature Communications》上的《Single-cell RNA landscape of intratumoral heterogeneity and immunosuppressive microenvironment in advanced osteosarcoma》在文章中多次用到了GSEA对细胞进行通路评分。其中，作者对骨肉瘤样本中捕获的10个髓系亚群进行了GSEA细胞通路评分，GSEA分析表明，M1-TAMs在IFN-α，IFN-γIL2/STAT5IL6/JAK/STAT3和炎症反应等通路上显示较高的活性，表明这些巨噬细胞可能来自于IFN-α和IFN-γ刺激的促炎微环境下，进一步发现，M1-TAMs显示出TGF-β和刺猬信号通路的活性升高，从而诱导M2极化。接下来作者使用GSVA发现有部分M2-TAMs 高表达M1-TAMs的marker基因，证实了M1-TAMs和M2-TAMs在骨肉瘤TME中的动态转化。
2018年发表于《Nature Medicine》上的《Phenotype molding of stromal cells in the lung tumor microenvironment》首先使用GSVA解析了内皮细胞、滤泡B细胞、巨噬细胞等hallmark通路评分，接下来，使用差异分析分别比较这些细胞类型下肿瘤细胞和非恶性细胞的差异。
发现了对比肿瘤和正常内皮细胞，Myc靶点是肿瘤内皮细胞中最富集的特征。在滤泡B细胞中，肿瘤相关的滤泡B细胞相较于非恶性相关的滤泡B细胞，在氧化磷酸化、细胞增殖和生物量产生活性下降（与Myc、mTOR和蛋白质分泌相关的途径)。与之对应的是，肿瘤相关肺泡B细胞的转录数比非恶性相关肺泡B细胞低37.9%。这也说明了在肿瘤中滤泡B细胞可能已经耗竭。
三：细胞通讯分析
细胞通讯作为研究细胞间互作的利器一直在很多高分文章中出现，细胞通讯的研究也有很多，常见的有CellPhoneDB、CellChat、NicheNet、NATMI、Celltalker等。这些方法各有特点，使用的配受体数据库也或有差异。基于研究物种类型、组织类型的差异需要合适选用。
接下来我们来看看细胞通讯分析的实例：
在2021年发表于《Nature Communications》上的《Tumour heterogeneity and intercellular networks of asopharyngeal carcinoma at single cell resolution》这篇单细胞鼻咽癌研究中，作者使用CellPhoneDB对CD8+T、CD4+T、NK、B、髓系和恶性细胞进行了分析。其中，预测DC_C3_LAMP3细胞通过CCL17-CCR4和CCL22-CCR4配受体关系与外周血中的Treg_C1_SELL细胞相互作用，这些CCL14将Treg细胞招募到肿瘤组织中。Treg_C4_TNFRSF4细胞中均有CTLA4、ENTPD1和CSF1的高表达，在DC_C3_LAMP3细胞上显示出配体-受体与CD80/CD86、ADORA2A和SIRPA结合，提示Treg_C4_TNFRSF4和DC_C3_LAMP3细胞之间可能存在相互作用。DC_C3_LAMP3细胞也被预测到通过CD200-CD200R信号通路与CD8_C11_PDCD1细胞相互作用，这是一种参与抑制抗肿瘤反应的非经典免疫抑制途径，此外还观察到Treg_C4_TNFRSF4和CD8_C11_PDCD1细胞之间潜在的配体-受体相互作用，包括趋化因子(CCL4-CCR8)、粘附连接(ITGAL-ICAM1和SELPLG-SELL)和免疫调节(HAVCR2-LGALS9)，这些在肿瘤TME中已经经过验证报道，促进Treg细胞的免疫抑制活性和CD8+T细胞衰竭。
今天的方法介绍就到这里，大家可以关注我们，我们会持续更新这个专题系列，为大家更新更多的研究方法与思路。
