2022-09-02
随着高通量测序技术的发展，不仅让我们对微生物的群落结构和功能有了更全面的了解，同时也产生了大量的原始测序数据。原始数据上传公共平台并发布，即是对自身数据的真实性、可重复性的一种验证依据，同时也是对所研究领域内信息发展，数据再利用做了贡献。
但现实是我们在上传过程中往往会遇到各种各样的问题，在某一个步骤中重复出现“error”，各种报错但又找不出具体原因，距离成功往往就只剩一步~
今天小编就将目前最新的完整宏组学数据上传步骤与各位分享，您值得拥有！
1、进入NCBI_submit向导
NCBI数据上传网址：https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/
进入网址，点击图片右上角Log in，进入登陆界面；
需要注意的是目前NCBI登陆需要第三方账号，原来注册的NCBI账号可能已经停用，这里推荐用截图中红框内的ORCiD或者Microsoft账号登陆，当然如果老师有其他账户也可以选择登陆~
账号登陆后下拉网页找到Sequence Read Archive (SRA)，点击Submit即可。
2、SRA提交
2.1创建new submission
进入SRA提交页面，点击New submission。
2.2 Submitter信息填写
确认无误后，点击continue（“*”标注为必须填写，其余内容选填）；
2.3 General Information信息填写
第一个红框为bioproject号填写，由于没有申请，故选择NO；
第二个红框为biosample申请，由于没有申请，故选择NO；
第三个红框为数据公布时间选择，前者为上传后立即公布，后者为选择指定日期公布，可根据需求进行选择；
填写完后，点击continue，进行下一项。
2.4 Project Info信息录入
此步骤为bioproject申请，需要填写红框标注的“*”部分：
第一个红框中需要填写项目标题，有固定格式“*+metagenome”，如土壤类型项目“soil metagenome”，肠道类型项目“gut metagenome”等等；
第二个红框中需要填写样品信息描述，比如采样地点、深度、类型等等；
填写完后，点击continue，进行下一项。
2.5 Sample Type选择
2.6 Biosample Attributes信息录入
选择第一个红框为线上填写样品信息；
选择第二个红框可以下载表格填写样品信息，以下载表格为例进行说明；
表格打开如上图所示，填写完相应信息后将表格保存为txt格式上传到网页中；
*注意：多样品上传表格填写的信息如果所有样品均一致，NCBI会默认为是同一个样本，出现报错提示，所以建议样本信息不要完全一样，可以在样本采集时间一栏中小幅度更改采样日期时间；将鼠标移至表头红色三角处，可显示对应表格填写示例规范，collection_data中可填写的示例有1990-10-30T14:41:36Z，那么我们在填写这部分信息时可将采样的具体时间，即T后面的信息做小幅度修改，或按照您真实的采样时间填写，这样可以保证每个样品的信息不一致；
PS：经过测试，提交表格后会出现黄色框warning信息，不要紧张，可以忽略，continue进行下一项~
2.7 SRA metadata信息录入
选择第一个红框为线上填写样品信息；
选择第二个红框可以下载表格填写样品信息，以下载表格为例进行说明；
表格中每一列均需要填写相应信息：
sample_name：上传样本名称；
library_ID：与上传样本名称一致即可；
title：如果是做的是16s项目，可以填写“sequences of bacteria”，如果是做的真菌项目，可以填写“sequences of fungi”，如果是某功能基因的项目，可以填写“sequences of * gene”；
library_strategy：如果老师的项目是菌群多样性检测，或者扩增子项目，选择AMPLICON；如果是宏基因组项目选择WGS；如果是宏转录组项目选择RNA-Seq；
library_source：菌群多样性检测，或者扩增子项目以及宏基因组项目选择METAGENOMIC；宏转录组项目选择METATRANSCRIPTOMIC；
library_selection：菌群多样性检测，或者扩增子项目选择PCR；宏基因组项目选择RANDOM；宏转录组选择RT-PCR；
library_layout：单端测序选择single，双端测序选择paired；
platform：根据测序所用平台进行选择；
instrument_model：根据上一列选定结果，继续选择仪器型号；
design_description：简单描述下实验设计思路，如测序区域信息等等；
filetype：上传数据的文件类型，比如Illumina平台测序原始数据类型为fastq格式；
filename/ filename2：填写上传文件的名称，需要注意的是上传文件的名称必须与文件一致，包括后缀名也要加上，如Illumina NovaSeq平台为双端测序平台，每个样本原始数据均有R1和R2两个文件，1_R1.fastq\1_R2.fastq，那么分别在filename/ filename2填写这两个文件名称即可；如果是压缩文件，也可直接上传，加入压缩文件的后缀名即可，如1_R1.fastq.gz/2_R2.fastq.gz；
上述表格信息填写完毕并保存后，点击浏览，上传该文件即可；
出现如上warning信息不要紧，可以继续点击continue，进行下一项；
2.8 Files数据上传
方法一：在线上传
选择在线上传数据，并在浏览中选择要上传的原始数据文件，待所有文件上传成功后，点击continue；
*在线上传适合样品不多，数据量不大的项目
方法二：Aspera插件上传（推荐）
插件如何下载？返回SRA首页~~
点击Aspera Browser plugin，会自动跳转至下载页面；
下载完成后，按提示安装软件即可；
返回我们上传的页面位置，并打开Aspera插件，该插件上传数据需运行dos命令行窗口，键盘“win+R”搜索cmd即可，如下图；
首先在dos运行命令窗口中需要先找到软件安装的位置，一般默认安装在C盘中；运行NCBI中给出的命令行（将上图中第二红框中的信息复制粘贴到cmd窗口中即可）：
ascp -i<path/to/key_file>（之前下载key file文件，并带上文件路径信息） -QT -l100m -k1 -d<path/to/folder/containing files>（数据存放的路径，需注意目录以“\”结尾）subasp@upload.ncbi.nlm.nih.gov:uploads/*******@163.com_CEFVcPsr
成图如下：
点击回车键即可自动上传，而且速度很快，适合多样品及数据量较大的项目；
数据上传完后等待10分钟左右时间，点击Select preload folder，在新窗口中点击Refresh folders即可查到之前上传的文件信息，如果还没有出现，再继续耐心等待~
选择好上传的文件后，点击网页下方continue，进入上传数据的最后一项内容；
2.9 Overview信息回顾
查看上传样本信息是否有误，如无问题，点击Submit；
3、 序列登录号获取
所有步骤完成后，网页会自动跳转至SRA界面，申请的相应提交进程处于processing；根据不同的样本量需要等待时间不等，一般情况下是24h内即可完成，待相应进行变为Processed后，可以查询序列登录号；
登入网址https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra_sub/会出现如下界面 ：
点击红框链接NCBI PDA，网页自动跳转如下页面：
其中SRP编号即为我们需要的序列登录号。
