2022-12-02
宏基因组（Metagenome）和宏转录组（Metatranscriptome）是通过鸟枪法测序技术（Shotgun sequencing），结合全微生物组关联分析（Microbiome-Wide Association Studies，MWAS）的策略，分别从DNA/RNA水平，全面精细地展示整个微生物群落的物种组成谱、功能代谢谱、表达谱，进而从原理上阐明微生物群落在生态系统中发挥作用的根本机制。
对于数据量和信息量都非常庞大的宏组学研究而言，选对分析软件和数据库至关重要。历经多年发展，目前能用于宏基因组和宏转录组分析的软件已然数不胜数，对于分析者而言，可谓“甜蜜的烦恼”！那么，在琳琅满目的分析方法中，究竟哪些才是当前宏组学的“网红”呢？本期，我们为您推荐以下软件和数据库，大家走过路过千万不要错过哦~
MMseqs2
MMseqs2 (Many-against-Many sequence searching，https://github.com/soedinglab/mmseqs2)是一款集核苷酸、蛋白质序列检索、回帖、聚类、注释等功能模块于一体的强大软件。今天，我们就来介绍MMseqs2 的taxonomy模块。作为宏基因组微生物物种注释的新工具，MMseqs2_taxonomy发表在2021年的Bioinformatics上（https://academic.oup.com/bioinformatics/article/37/18/3029/6178277?login=false）。
对于待注释的氨基酸/核酸序列，MMseqs2_taxonomy 首先通过其search模块提取数据库中所有可能的氨基酸序列片段，并快速保留有助于分类注释的片段，再通过加权方式确定其分类身份（如下图A）。其亮点是在于提出了2bLCA (dual BLAST based last common ancestor) 和 a-2bLCA (Approximate 2bLCA) 算法，来解决LCA算法在实际操作过程中如何确定备选序列数目的难题，在确保稳健性的同时，显著提高了宏基因组物种分类注释的精准度（如图C）。
为进一步展示a-2bLCA算法的优势，小编特意使用宏基因组的实际数据，将该算法与LCA和TopHit算法进行了比较（如下图），图中是s1-5表示采用的灵敏度等级。结果显示，TopHit算法虽然获得了精细的注释信息（更多注释到了species水平），但由于是单一选择匹配度最高的注释结果，其结果并不稳健；而将a-2bLCA的结果与LCA进行比较，可以发现2bLCA算法能精确到species水平的序列更多。
LCA vs. 2bLCA vs. TopHit算法在不同分类水平下注释到的序列比例
GTDB基因组分类数据库
GTDB基因组分类数据库（https://gtdb.ecogenomic.org/），全称Genome Taxonomy Database，它基于大量基因组系统发育分析构建的基因组分类标准流程体系，对现有的大量微生物基因组进行了重分类。该数据库已经于2018/2020连续发表两篇Nature Biotechnology，配套软件GTDB-tk于2019发表于Bioinformatcs，在提供微生物分类参考数据库的同时，也提供了微生物基因组物种分类、进化树构建的全套工具，绝对是服务到家的好工具。
目前该数据库涵盖了317542个微生物基因组，由311480个细菌和6062个古菌基因组组成（如下图）；并分为65703个种水平分类单元，由62291个细菌和3412个古细菌构成（如下图）。
下图显示了GTDB的65703个代表基因组的新注释结果与其在NCBI分类系统中的差异分布。如果一个基因组的新物种名称与其在NCBI分类系统中相同，则标注为Unchanged（不改变其分类）；如果NCBI中没有物种分配，则标注为Passive change（被动更改）；如果其新物种名称与NCBI分类不同，则标注为Active change（主动更改）。
我们再使用数据实测一下，使用GTDB-prot（GDTB基因组数据库中提取的蛋白序列数据库）和NCBI-nr数据库进行蛋白序列注释的效果（如下图，注意，我们只统计了原核部分），可以发现GTDB与2bLCA的组合结果最为高效，且GTDB相比于NR数据库在原核微生物注释的精细程度方面更具优势。
GTDB数据库与NR数据库2bLCA vs. TopHit算法的结果比较
MMseqs2在其发表的文章中声称比CAT工具快2-18倍，而CAT在今年推出的更快的diamond2 软件 (这个软件我们会在下一期具体评测) 的加持下，在速度上也许可以超过MMseqs2。尽管如此，为了使用2bLCA算法，以便获得更准确的注释信息，我们仍旧推荐使用MMseqs2_taxonomy作为宏基因组微生物物种注释的最佳方法。
此外，由于GTDB数据库中仅有原核生物的信息，若想获得更为全面的注释结果，或许可以考虑将NCBI-nr中的真核序列、病毒序列与GTDB-prot进行整合，这样运用于宏基因组物种注释将更为得心应手。
以上就是我们本期精心整理的宏组学软件和数据库推荐，在此给大家抛砖引玉啦~这些软件和数据库，都将纳入派森诺最新宏组学分析流程中，欢迎大家尝鲜体验！
