2022-12-29
为了解决临床上大多保存样本类型FFPE样本的有效利用，10x Visium FFPE空间基因表达分析能够突破以往用福尔马林固定-石蜡包埋（FFPE）组织切片进行空间基因表达分析存在的障碍，释放那些隐藏在样本中的信息。Visium FFPE 空间基因表达分析作为一种突破性的解决方案，将组织学技术的优势与RNA测序的高通量和发现能力融入FFPE组织样本中，可对病理学家主导的传统分析进行补充。它能够以高分辨率对整张组织切片进行分析，从空间上分析人和小 鼠FFPE样本中超过18,000个基因的RNA表达。通过全转录组分析以及适用于FFPE组织分析的专业试剂，您能够检测任何通路中的任何基因，分辨组织异质性，并在形态背景下揭示各种细胞类型和细胞状态的空间分布。
技术亮点 • 采用RNA模板连接（RTL）探针组来确保高灵敏度和高特异性； • 重新分析长期保存的生物库样本以发现生物标志物，或开展回顾性研究和纵向研究，在一段时间内追踪生物过程； • 摆脱只分析预先定义的目标范围的限制，可分析整张FFPE组织切片； • 与免疫荧光相结合来观察蛋白质和基因表达，或与H&E染色相结合来观察形态背景。 （来自10x官方资料）
技术原理 针对FFPE样本的特殊性，10x Visium目前针对小鼠和人的超过18,000个基因数据库设计了探针，每一个基因都有一对probe以靶定RNA的特定序列，LHS（左端探针）带有read2序列，用以后续PCR扩增，RHS（右端探针）带有polyA序列，用以后续被玻片上的探针捕获结合，通过probe与组织内RNA杂交，将RNA信息转移到probe上，再将探针两端连接形成完整的DNA链。之后降解杂合RNA链，然后透化释放连接的probe，完成信息捕获过程（FFPE样本不需要针对不同类型的样本摸索透化条件，所有的样本类型都用同样的透化条件）。捕获的probe在玻片上进行延伸反应，生成cDNA，回收单链cDNA并构建测序文库进行上机测序，从而获取基因表达信息。载玻片上的每个捕获区域都有一个oligo阵列，每条oligo上包含与probe结合的捕获探针，该oligo同时具备描述空间信息的标记性序列。 FFPE样本Visium空间转录组原理（来自10x官方资料）
实验步骤 1、样本质检 由于10x visum的芯片捕获区域只能容纳6.5*6.5的组织大小，因此建议FFPE样本的取材样本大小尽量不超过该面积（送石蜡包埋组织的话，尤其注意），FFPE样本的厚度在5um-10um，切片建议是送15张左右的片子。 切片样本先进行RNA质量的检测，一般是要求长度大于200bp的RNA 片段占比能大于50%，即DV200>50%。 Agilent RNA 6000 检测结果展示（来自10x官方资料） RNA质量满足质控要求后，对切片进行组织粘附性质检也称脱片质检。脱片质检的目的是保证正式实验样本切片能牢固的粘附在玻片上，防止后续实验过程中加各种试剂或洗涤浸水导致切片脱落。首先对切片进行脱蜡，染色，复水，然后显微成像，以观察切片的脱片情况。 组织粘附的定性评估（来自10x官方资料） 质检合格后，将FFPE组织切片放置在空转的表达芯片上，并进行组织学成像，H&E染色观察组织的形态学是否满足正式实验需求。挑选符合需求的正式实验样本进行实验。 2、正式实验 确认好具体的切片情况后，在正式玻片上进行贴片： 之后进行探针杂交，探针连接，组织透化，探针延长，cDNA扩增，文库建库，上机测序： FFPE样本Visium空间转录组流程（来自10x官方资料）
数据分析比较 与适用于新鲜冷冻组织的Visium方案具有可比性: 比较结果发现，Visium FFPE 空间基因表达解决方案是高度灵敏、高特异性且可重现的。（来自10x官方资料） A. Visium FFPE 空间数据与Visium 新鲜冷冻组织数据表现出高度相关性，证明了这两种检测的结果具有可比性，且具有高灵敏度。B. Hpca的空间mRNA表达数据证明了其在新鲜冷冻以及FFPE样本的海马体中表达，并与已知的表达模式相吻合，证明了Visium FFPE 分析的特异性。C. 取自小鼠脑组织FFPE样本并采用Visium FFPE空间分析处理的连续切片显示出高的重复性，无论是检测到的聚类还是总的唯一分子标识符（UMI）。 对两年之久的FFPE肿瘤样本中约18,000个基因进行检测： 检测说明Visium FFPE 可以对长期保存的FFPE组织样本的全转录组进行分析，并具有完整的组织覆盖度。（来自10x官方资料） （A）H&E染色的图像；（B）Visium FFPE全转录组分析数据叠加到H&E染色结果上；（C）B结果的点聚类分析。（D）三个关键的乳腺癌基因的表达水平和空间分布：ERBB2（HER2）、孕激素受体(PGR）和雌激素受体（ESR1）。
