2023-01-05
自单细胞测序面世以来，组学研究被推进到单细胞分辨率层次，一直是基础科学研究领域的热点。然而，想要做单细胞的各位，是否遇到过以下问题:
⏩临床样本病理结果需要数天后才出，而单细胞要求样本越新鲜越好，那对于病理暂不确定的样本，做还是不做？
⏩大型队列样本取样周期长，不同批次实验上机是否会有批次效应？
⏩样本或细胞状态脆弱，万一在长距离运输过程中失活了怎么办?
⏩想捕捉细胞处理后的短期快速变化，一些客观原因又导致无法进行上门实验，那还能做单细胞测序吗？
别着急，一款新的产品Single Cell Fixed RNA Profiling Kit 完美解决以上所有问题！
Fixed RNA实验原理
Fixed RNA Profiling是10x Genomics于今年新推出的一个产品，与3’单细胞转录组相比，其主要核心就是以4%的多聚甲醛（PFA）对细胞进行固定，可保存样本的瞬时状态，打破样本的保存时限。由于样本经过固定，所以10x不再用捕获mRNA Ploy-A尾的方式进行单细胞mRNA的捕获，而是针对人和小鼠的已知基因，设计了约18000种的探针对，其中低表达量的基因设计了包含三个探针对，高表达的的基因则设计了一个探针对。探针首先会和mRNA杂交，后续探针上的PCS1序列和beads上的partial Capture Sequence 1结合，从而引入10x barcode序列。除此之外，探针上携带的Probe Barcode还可以实现样品间的条码区分，支持1-16个样的混样测序。 图1. 多聚甲醛固定细胞状态 （图片引用自10x Genomics官方材料） 图2. Fixed RNA 探针结构示意图 （图片引用自10x Genomics官方材料） 图3. Fixed RNA 探针和beads结构示意图 （图片引用自10x Genomics官方材料）
Fixed RNA工作流程
首先用4%的多聚甲醛（PFA）将样本进行固定，然后进行探针杂交，杂交完成后进行建库测序，最后用Cell Ranger进行分析。 图4. Fixed RNA 实验工作流程 （图片引用自10x Genomics官方材料）
Fixed RNA数据展示
① 固定细胞的存储稳定性很好：对固定后立即运行（第0天）、在4°C存储一周或在-80°C存储一个月的人类PBMC开展单细胞基因表达分析。主要的细胞类型群体随着时间的变化而保持稳定，表明PFA固定能够锁定生物学状态，实现运输和存储，从而缓解单细胞实验的限制。
图5. 固定细胞的存储稳定性 （图片引用自10x Genomics官方材料） ② 固定样本测序数据质量与3’单细胞基本一致：对不同的样本类型分别进行了Fixed RNA和3’单细胞基因表达分析，两种方案中位基因基本一致甚至Fixed RNA的数据中位基因要优于3’单细胞，这可能是因为探针捕获的灵敏度更高。 图6. 对不同样本类型分别进行Fixed RNA和3’单细胞基因表达分析 （图片引用自10x Genomics官方材料） ③ 固定样本混样测序数据质量影响不大：对人类PBMC进行固定并分成16个样本，每个样本与一组带条形码的探针进行杂交。将样本混合，并放入Chromium X芯片的单个通道中运行。A. t-SNE图显示了叠加在一起的所有混合物的80,000个细胞，而不同的cluster代表了每种细胞类型。B. t-SNE图显示了按条形码拆分相同数据，以证明不存在批次效应，而且混样分析是一种有效策略，可降低单细胞实验的可变性，同时大大提高样本通量。 图7. 对固定样本的基因表达数据开展细胞聚类分析 （图片引用自10x Genomics官方材料）
Fixed RNA 技术优势
打破样本保存时限，病理分型样本不再为难 组织和细胞悬液均可固定，固定后的样本在4℃可储存一周，-20℃/-80℃最多可储存3个月，允许确定好样本病理情况再决定是否做单细胞。 解决珍贵和脆弱样本的实验限制 将样本拓展到脆弱和珍贵细胞，不再担心路途运输导致细胞死亡。 锁定细胞状态快速变化的瞬间，不再担心外界压力导致细胞内部转录状态的变化。 操作简易且分析结果一致或优于3’单细胞 多聚甲醛固定样本操作简单方便，最终数据与3’单细胞相差不大，某些低表达基因检出率甚至优于3’单细胞。 支持混样测序，降低实验成本 一个孔内最多可以支持16个样本混样，单个样本细胞数最多能到8000，对于细胞量不够或样本规模较大的项目，可大幅降低实验成本。 降低批次效应 可以把不同时间取样的样本实现同批次实验上机测序分析，减少样本批次效应。
Fixed RNA 送样前Q&A 问：1.Fixed RNA送样要求 答： 问：2.Fixed RNA适用物种和样本类型： 答：因为Fixed RNA是基于探针来捕获mRNA，因此需要物种有对应的探针集。目前Fixed RNA仅适用于人，小鼠后续会推出。样本类型目前新鲜/冷冻组织、血液，细胞系、冻存细胞、细胞/核悬液等均可适用。 问：3.样本固定步骤可以自己进行吗? 答：如果您需要自己固定我们可以为您提供Fixed RNA 实验方案和相关试剂；也可以选择将样本送至公司，公司解离后进行固定步骤和保存。由于公司在实验和质检判定方面经验更丰富，建议是由公司来进行解离和固定操作。 问：4.单细胞核测序和Fixed RNA都可以解决样本保存难题，该如何选择实验方案？ 答：单细胞核测序适用某些受限于组织类型或保存方式无法做单细胞测序的，比如： 1）细胞直径过大或形状不规则，如神经元细胞、心肌细胞等，只能做抽核； 2）组织样本已冷冻保存； Fixed RNA 适用于要做单细胞，但是又遇到以下情况的： 1）需要等病理结果出来才能确定该例样本是否满足入组条件； 2）细胞状态变化较快，关注某一确定时间点细胞内转录变化的； 3）样本或细胞比较脆弱，易降解，无法承受长途运输又不方便进行上门实验； 4）担心不同批次实验可能导致的批次效应或想要降低实验成本
