2023-04-05
近年来，高通量测序技术一直被广泛应用于微生物群落组成和功能的研究中。然而，在进行微生物的定量分析时却面临了一些困难。由于扩增效率、核酸提取和测序深度等多种因素的影响，传统的扩增子测序所得到的只是细菌的相对丰度信息，无法准确地获得样品中各种细菌的绝对数量。
传统的qPCR技术存在一些局限性，特别是对于复杂的样本类型来说。由于引物限制和重复性等原因，传统的qPCR技术无法可靠地适用于微生物多样性丰富的样本中。此外，在qPCR技术中引物的设计和优化是一个非常繁琐和费时的过程，如果设计不当，甚至可能导致实验结果的错误或不准确。
为了解决这个难题，派森诺推出了16S绝对定量扩增子测序技术。该技术利用特有的人工合成内标，将16S扩增子测序技术与qPCR绝对定量技术合二为一，充分发挥16S扩增子适用范围广的优势，避免由于PCR效率及建库方法不同等因素引起的偏差，提高了数据的准确性和可比性。一次测序，便能获得样本中各细菌的丰度和绝对拷贝数等信息。
实验流程介绍
16S绝对定量扩增子技术基于正常扩增子测序流程，在样品DNA中加入已知拷贝数的内标序列（12～15种），这些内标是自然界不存在的人工合成DNA片段，长度与16S rRNA基因片段相似，可被16S rRNA常规V区引物如V3V4、V4V5等区域引物扩增。在PCR扩增阶段，内标序列与目标16S rRNA基因共同扩增，构成混合的扩增产物。随后进行文库制备和测序，得到大量的tags序列信息。 通过计算每个内标理论拷贝数与测序中检测到的实际tags数之间的比例，绘制出标准曲线。该曲线展示了内标已知拷贝数与测序tags数之间的关系，是校正样品中细菌绝对丰度的关键。标准曲线可以用于计算每个样品中不同OTUs/ASVs的绝对拷贝数，即真实菌群数量，从而精确地反映出微生物群落的组成和丰度。 图1：技术路线图
实测数据结果：
常规16S扩增子测序 VS 16S绝对定量扩增子测序 图2所示：为两种技术手段获得的前20种属水平细菌群落相对丰度；其中Sample1/2为常规16S扩增子测序所获得的结果，Samlpe1/2-添加内标为16S绝对定量扩增子测序所获得结果。从数据分析结果可以看出，两者数据分析结果基本保持一致，种群丰度及构成无明显变化，说明添加内标基本不会影响样本的群落组成。 图2 图3/4所示：图3为常规16S扩增子测序所获得的最终数据结果；图4为16S绝对定量扩增子测序所获得的最终数据结果；从图3与图4的显示的结果来看，16S绝对定量扩增子测序能够更加直观并真实还原样本本身的细菌含量。 图3 图4
主要优势
🔷相比于qPCR绝对定量技术，16S绝对定量扩增子测序技术实操更加简便，具有更高的通量和更广泛的应用范围。 传统qPCR定量技术需要设计特定的引物和探针，多数只能检测特定的微生物，并且在低通量平台上运行，一次只能分析少量的样品，存在限制。 相比之下，16S绝对定量扩增子测序技术使用的是通用引物，避免了由于引物和探针的特异性和扩增偏好性不同带来的偏差，只需要对样本进行DNA提取、PCR扩增和建库测序等简单操作即可获得样本中所有细菌的种类和准确数量，从而更全面地了解环境微生物群落的组成和结构。 🔷与常规16S扩增子测序技术相比，16S绝对定量扩增子测序技术可以尽可能消除PCR扩增以及测序等因素对样本内细菌群落的定量分析的影响。 常规16S扩增子技术只能根据序列信息推断得出微生物的种类和相对丰度，并不能直接反映微生物在样本中的实际存在数量，需要通过外部标准曲线或其他方法将相对丰度转换为绝对丰度。 16S绝对定量扩增子测序技术会针对每一个样本绘制相应的标准曲线，从而得到样本中微生物的准确数量，避免了由于PCR扩增效率、测序深度和数据处理等因素引起的偏差。如图3/4所示，使用传统16S扩增子技术得到的微生物相对丰度看起来一致，但其实真实含量相差了几倍。 🔷16S绝对定量扩增子技术可以真实还原样本内细菌群落的确切含量，为科研提供更加精准的数据参考； 相比于传统的定量方法，如菌落计数等，16S绝对定量扩增子测序技术具有更高的精度和灵敏度，依据实验每个环节的具体参数，逐级还原初始生物学样本内细菌群落的确切含量。
主要应用
16S绝对定量扩增子测序能够更好地溯源样本内微生物群落的真实情况，因此其应用的方向也会相比常规检测手段更加宽泛（如图5所示）。 图5 总之，16S绝对定量扩增子测序技术是一种非常有前景的技术手段。与其他相关技术相比，16S绝对定量扩增子技术具有操作简便、获取信息多、准确性高等优点。在保持扩增子测序检测范围优势的同时，能够真实还原样本内细菌群落的确切含量，为探究微生物群落组成及其在不同环境下的变化等研究提供更加准确的数据参考，对于研究微生物群落的生态学特征和变化规律具有重要的意义。
