2023-07-05
一、什么是代谢组学？
代谢组是指某一生物或细胞、组织在特定生理时期内的所有小分子代谢物（一般<1200 Da）集合称为代谢组；代谢组学则是对代谢组进行定性和定量分析，并研究该代谢组在干预或疾病生理条件下动态变化规律。 表1 常见代谢物种类及主要功能
二、为什么要做代谢组学？ 基因组学会告诉你可能发生了什么；转录组学告诉你即将要发生什么；蛋白组学指出什么东西致使它发生；只有代谢组学会告诉你已经发生了什么或正在发生什么，它是连接微观和宏观的桥梁，代谢组水平的改变能够导致宏观表型的改变。作为中心法则最下游，代谢组能够将基因组和蛋白组结果放大。基因和蛋白的微小改变会引起代谢物代谢物水平的改变，容易被检测，还能够与生物体部分表型建立相关性。此外，各物种代谢物数量远小于基因和蛋白质，结构也更加简单，常见的代谢物在不同生物中相似度较高，更具有普适性。 图 1 各组学关系
三、代谢组学做什么？ 从实验目的出发，代谢组学分为非靶向代谢组学和靶向代谢组学。从名字可以看出，非靶向代谢组学是广泛的、无偏向性的检测样本中的代谢物，通过筛选差异代谢物及其通路的分析能够探究其发挥的生物学作用，以发现潜在的生物标志物，进而研究机理、药物治疗及疾病预测等，通量高，覆盖度广，但依赖数据库，数据处理麻烦，灵敏度有限，部分低丰度物质无法被检测到。靶向代谢组学则需要依赖标准品作为参照，对某些或某类特定的代谢物进行有针对性的、特异性的绝对定量检测，灵敏度高，定量准确，检测下限比较低，但依赖标准品，代谢物覆盖有限。表中列出了常见的代谢组学检测内容。 表2 代谢组学检测内容
四、代谢组学怎么做？ 非靶代谢组学的检测方法主要是核磁共振法（NMR）、液相色谱串联质谱法（LC-MS）和气相色谱串联质谱法（GC-MS）。各方法优缺点如下表所示。近年来，高分辨质谱的快速发展能够很好弥补NMR的短板，质谱法也因此成为非靶代谢组学最常用的方法。 表3 NMR、LC-MS、GC-MS优缺点 靶向代谢组学则主要使用串联质谱法，相比于非靶代谢组所使用的高分辨静电场轨道阱（Orbitrap）和飞行时间（Time of Flight）质谱仪，靶向代谢组学大多使用的低分辨四级杆（Quadrupole）、线性离子阱（Linear Ion Trap）质谱仪的质谱灵敏度更高，扫描速度更快，检测线更低，定量更准确。 在质谱法中，由于液相色谱（LC）和气相色谱（GC）分离原理不同，使用LC-MS和GC-MS检测的代谢物也不同。LC-MS适用极性大、沸点高、难挥发的物质，GC-MS适用非极性或弱极性、易挥发的物质。在动物的内源性代谢物中，难挥发物质居多，因此LC-MS应用更为广泛。 要开展代谢组学研究，一般要经过下面几个流程。首先根据实验设计准备好样品，然后使用适当方法进行代谢物提取，提取后的样品上机检测得到质谱图。最后通过数据处理得到结果，最终深入分析和多角度挖掘有价值的生物信息。 图 3 代谢组学研究流程
五、代谢物如何进行定性定量？ （一）非靶向代谢组学 非靶向代谢组学常用的质谱扫描模式是高分辨质谱的数据依赖性采集（DDA/IDA），它的一个扫描周期包括一张一级母离子Full MS和若干张二级碎片离子的MS2。四级杆筛选Full MS中信号响应前N的母离子送到碰撞池做二级碎裂，然后采集碎片离子信息。搜库软件会对一级扫描的各母离子进行积分，得到其峰面积作为定量结果，然后再根据其MS2碎片离子信息与数据库进行匹配，最终确定该化合物是什么物质。 图 4 非靶定性定量原理 常用的搜库软件有Compoud Discover、Lipidserach、MS-DIAL、XCMS等。常用的代谢组学数据库有HMDB、KEGG、Metlin、mzCloud、massbank、LipidMaps等公共数据库及各实验室自建数据库。 （二）靶向代谢组学 靶向代谢组学常用的扫描模式是三重四级杆质谱的单反应监测（SRM）和多反应监测（MRM）。SRM模式针对某个特定的母离子及其一个指定的子离子，Q1筛选出特定m/z的母离子，Q2将其打碎，Q3扫描设定m/z的子离子。离子经过Q1和Q3的双重选择后由检测器采集特定离子对的信号。MRM模式相当于同时进行多个SRM扫描，可以同时检测多个离子对，因此成为靶向代谢组学最常用的扫描模式。靶向代谢组学（除广靶外）会用到已知化合物的标准品做参照，分子量和结构明确，无需进行定性。靶向定量是将标准品稀释到不同浓度后跟样品一起上机检测，将采集到的各标准品峰面积与进样浓度做标准曲线，利用标准曲线和样品中各化合物峰的峰面积计算得到准确浓度。 图 5 靶向定量原理
