2023-07-06
一、前 言
单细胞测序文库从Raw Data到Deduplicated Reads，其实是一个non-trivial的流程。从fastq文件下机开始，不同来源的Reads需经过层层计算和筛选，最终只有少部分Reads能保留在表达矩阵（或counts table）中。这里用一张图总结，以帮助我们更好地理解单细胞文库的建库和上游分析（Upstream Analysis）。
二、示意说明
流程图读法：从下往上读，不同颜色代表不同分析阶段的Reads；画斜条纹阴影的线段表示当前步骤到下一步中被清除掉的Reads。 黑色：Total Input Reads，一般我用的是测序下机后的Clean Reads（公司给的QC质控后的Cleandata） 黑色->紫色：umi_tools whitelist, wash_whitelist, umi_tools extract 黑色阴影：Reads with Non-correctable Reads, invalid Barcode & UMI (discarded) 紫色：Barcode有效的Reads（Reads with valid Barcode & UMI） 紫色->黄色：STAR 紫色阴影：Reads NOT Unique Mapped to Genome (discarded) 黄色：Unique Mapped Reads，在10X中也叫Confidently Mapped Reads（Unique Mapped, valid Barcode & UMI Reads） 黄色->绿色：featureCounts 黄色阴影：Unique Mapped, valid Barcode & UMI but NOT assigned to feature 绿色：Effective Reads，即Unique Mapped, valid Barcode & UMI, feature assigned Reads 绿色->蓝色：umi_tools count 蓝色阴影：Reads Collapsed due to UMI deduplication 蓝色：Deduplicated Reads，即最终用于生成表达矩阵的对Reads计数的结果 有了这张图，我们可以做一个简单直观的推论：如果想提高单细胞测序的技术质量，则必须尽可能减少阴影部分的Reads在总文库中的比例。
三、指导下游分析
仔细思考实验流程，会发现每个阴影部分会受不同因素的影响。 黑色阴影：主要影响因素之一是Barcode & UMI序列质量，即TSO引物质量；也有可能受TSO concatamer、RNA降解因素影响 紫色阴影：主要影响因素是样本制备质量，即细胞活率、异源RNA污染等 黄色阴影：主要影响因素是生物学样本内非mRNA成分的比例，如premRNA等，可能与样本本身生物学性质有关 蓝色阴影：主要与扩增循环数有关，该部分Reads过多可能是因为扩增循环数过高 “降低阴影部分比例”可以作为单细胞测序实验的一项指导原则，帮助我们进行实验条件的摸索，也可以作为单细胞技术开发的一项指导原则，帮助我们迭代优化试剂组成。
