2023-08-03
前言
眼睛、一个美丽而神奇的器官。
人类眼睛内部的眼球近似球状，由眼球壁和眼内容物构成。人的眼球壁由外至内依次为纤维膜、血管膜、视网膜。角膜作为眼球壁组成部分，是弯曲度大于眼球外壁其他部分的透明圆盘状结构；正常人角膜中央薄（约0.5mm）周边厚（约1.0mm）；角膜由无血管的结缔组织构成；含有丰富的神经末梢。
一、眼角膜结构简介
人的角膜分为五层，由前向后依次为：角膜上皮(corneal epithelium)、前界层(anterior limiting lamina )、角膜基质（corneal stroma）、后界层( posterior limiting lamina )、角膜内皮(corneal endothelium)。
由于角膜的特殊构成，在解离过程中会出现细胞量较少且脆弱容易凋亡的情况。经过测试优化，小派提供一种高效、稳定的角膜组织解离方案，可获得活性好、总量多、背景干净的单细胞悬液。
二、解离方案
1、提前配制复合酶解离液（含木瓜蛋白酶、DNase Ⅰ等）及蛋白酶抑制剂。
2、从组织保存液中取出角膜组织样本，放入预冷的 DPBS中清洗。
3、将清洗后的组织放到复合酶解离液中，用眼科剪将组织剪成碎片状，转移至含有剩余解离液的50ml离心管中，置于37℃水浴中震荡消化 30-90 min，期间可使用巴氏吸管轻柔吹打组织，使其充分接触解离液。
4、消化结束后，解离液通过 40um 细胞筛进行过滤，收集通过的细胞滤液至一新的无菌离心管中。
5、4℃，300 xg 离心 5 min，弃上清。向细胞沉淀中加入含蛋白酶抑制剂和DNaseⅠ的培养基重悬细胞，再通过低速离心，获得背景干净的细胞。
6、加入适量DPBS（含 2%FBS）重悬细胞，取20uL细胞悬液进行细胞计数和活力测定。（注：AOPI荧光计数、台盼蓝染色镜检）
三、结果展示
角膜组织
（注：新鲜组织短时间内取出，尽快放入到组织保存液，送到实验室）
镜检结果
单细胞悬液背景干净，细胞状态好
活性、浓度检测
细胞活性95%，浓度655个/ul，总量在15W以上。
数据质控
上图是下机数据cellranger质控结果，细胞捕获数及基因数都符合前期需求。
