2023-09-25
不同解剖部位的身体皮肤因其起源不同而显示出不同的基因表达模式，且这种内在的异质性可以在成年人中一直维持。然而，不同部位皮肤的高分辨率单细胞特异性较少被揭示。
2023年6月，华大自主单细胞DNBelab C系列平台助力四川农业大学生命科学学院动物学系、成都市畜禽遗传资源保护中心、华大基因共同于eLife（IF=7.7）杂志发表题为” A single-cell transcriptome atlas of pig skin characterizes anatomical positional heterogeneity”的文章
成华猪是我国著名地方猪种，其极厚皮肤性状成为该品种的重要特征。该研究选取了成华（CH）猪的以皮肤厚度存在显著差异的六个解剖部位皮肤组织以及大白（LW）猪的背部皮肤组织作为研究对象，分析了不同皮肤区域的细胞类型和功能特征，构建了猪皮肤单细胞转录组图谱，鉴定出以平滑肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞数量为主的7种细胞类型、21种细胞亚型（如所属成纤维细胞的乳头、网状和间充质3种细胞亚型），揭示了与解剖部位和品种关联的特异基因表达模式及其参与皮肤免疫反应和细胞外基质（胶原蛋白为主）合成的生物功能，为进一步研究皮肤发育和生理功能提供重要线索。其中，高通量单细胞转录组建库测序及分析由华大基因完成。
样本设计
该研究收集了3头雌性CH猪（180日）6个不同解剖部位皮肤：头部、耳朵、肩部、背部、腹部、腿部以及3头雌性LW猪（180日）背部皮肤样本进行高通量单细胞转录组测序（scRNA-seq）。
技术点睛
1. 完整的猪皮肤单细胞转录组图谱
该研究完整绘制了猪皮肤单细胞转录组图谱，且详细分析了主要细胞群SMCs（平滑肌细胞）、ECs（内皮细胞）、FBs（成纤维细胞）在不同部位皮肤的异质性，从单细胞水平揭示了其在不同部位皮肤的表型特征。
2. 挖掘出影响成华猪独特皮肤厚度的关键基因及信息传递机制
该研究采用CellChat完整构建了猪皮肤细胞间的通讯交流网络，提出FBs、SMCs和ECs之间的通讯交流机制。并且，该研究挖掘出COL11A1、TNN、INHBA基因是影响成华猪独特皮肤厚度的关键基因，COLLAGEN和LAMININ信号通路是介导成纤维细胞与平滑肌细胞/表皮干细胞的主要细胞通讯模式。
图1 技术路线
研究结论
1. 成华（CH）猪不同解剖部位皮肤的单细胞转录组图谱绘制
研究团队对CH猪的头部、耳朵、肩部、背部、腹部和腿部的皮肤组织进行scRNA-seq，获得了233,715个细胞，聚类定义后分出7个细胞群。每种细胞类型的Marker基因表达谱揭示其独特的生理功能相关的特征。考虑到跨物种，本研究对猪、人类和小鼠皮肤的细胞图谱进行对比，发现三个物种的细胞类型相似，但细胞数占比不同，可能是CH猪独特的皮肤厚度导致细胞类型比例的差异（例如SMC和EC细胞数量过多），作者建议可将猪皮肤组织作为人类皮肤模型用于单细胞水平上的研究。
图2 CH猪不同皮肤解剖部位单细胞转录组图谱
2. 平滑肌细胞（SMCs）在不同解剖部位皮肤的异质性差异显著
SMC在皮肤组织中形成血管和APM中发挥着关键作用，尚无研究以单细胞分辨率对皮肤SMC进行表征。t-SNE分析将SMC分为五个亚群（cluster 0、2、5、6和 13），GO分析表明SMC在血管功能和稳态、部分胶原蛋白结合以及皮肤组织的免疫反应中发挥着重要作用。结合GO分析和Marker基因表达水平，推测cluster 2是间充质样型细胞，cluster 5和cluster 6是巨噬细胞。研究团队通过Monocle算法进行拟时间轨迹分析，获得 SMC分化到间充质样型以及从间充质样型到类巨噬细胞的动态变化，同时特征基因集的动态变化也验证了这个结论。
图3 不同解剖部位皮肤平滑肌细胞（SMC）的异质性
SMCs的细胞数量在不同皮肤部位表现出显著差异，而SMC亚群的分布比例相似的。作者分析与ECM整合蛋白、免疫反应相关的基因在不同皮肤部位的表达变化，发现免疫反应基因与肩部皮肤密切相关，ECM整合蛋白基因与头、背部、肩部的皮肤紧密相关。此外，作者使用单细胞调控网络推理和聚类（single-cell regulatory network inference and clustering, SCENIC），获得EGR1、ATF3、NFKB1、PRDM1、REL等关键转录因子及其相关靶基因。尤其是ATF3和EGR1是主要调控背部皮肤的靶基因。以上结果为不同部位皮肤SMC的固有异质性提供了很好的见解。
3. 内皮细胞（ECs）在不同解剖部位皮肤的基因及代谢通路等表现显著异质性
前人研究发现EC是血管系统的基础，主要参与调节血液和皮肤的稳态。EC细胞群再分类成小动脉EC（cluster7和10）、毛细血管EC（cluster 3）、淋巴管EC（cluster 11）。拟时轨迹分析展示了从动脉开始到静脉结束的有序血管轴，并形成了动脉- 静脉吻合的趋势。由于EC表型表现出不同的分子和功能，作者也进一步探讨了这些EC表型相关基因的表达水平，发现不同的EC表型显著高表达不同的基因，包括与整合素、免疫和代谢相关的多个基因，体现EC表型的功能多样性。为进一步确认六个不同解剖部位的 EC 表型异质性，作者详细比较了整合素、免疫和代谢途径的基因表达水平。不同部位EC表型相关通路基因表达的丰富结果显示了不同解剖部位皮肤EC的异质性。此外，作者构建EC单细胞转录因子调控网络。
图4 不同解剖部位皮肤平滑肌细胞（SMCs）的异质性
4. 成纤维细胞（FBs）不同解剖部位皮肤的异质性与皮肤形态差异相关
FB合成ECM，形成皮肤真皮的结缔组织，以维持皮肤形态，如厚度和稳态。切片染色结果表明，CH猪不同部位的皮肤厚度存在显著差异，例如背部平均厚度为5.48mm，而耳朵为1.52mm。从整体皮肤切片来看，不同部位的皮肤组织形态存在一定差异，胶原纤维的稀疏程度或附属器的数量以及真皮厚度从背部、头部、肩部、腿部、腹部到耳朵依次递减。
那么不同皮肤部位ECM积累的差异是否是由 FB 异质性引起呢？
研究团队从头部、耳部、背部、肩部、腹部和腿部六个不同部位细胞聚类分析，发现 cluster1、8、9和12与ECM组织、胶原蛋白密切相关。比较不同部位基因的表达水平，GO分析发现所有组别比较的结果与ECM、细胞外区域、细胞外空间和含有胶原蛋白的ECM通路相关；KEGG分析发现主要通路与ECM的产生紧密相关。作者认为TNN、COL11A1和INHBA是引发ECM积累的关键候选基因。
FBs相关基因表达特征可以作为位置同一性的重要分子线索，比较不同部位基因表达差异结果表明厚部位（头部、肩部和背部）和薄部位（耳朵、腹部和腿部）的 FBs 基因表达模式部分由每个结构的位置定义；上半身部位（头部、耳朵和肩部）和下半身部位（背部、腹部和腿部）的由其起源的解剖部位决定。
图5 不同解剖部位皮肤内皮细胞（ECs）的异质性
5. 不同品种猪皮肤的细胞异质性存在显著差异
前期研究发现，CH猪和LW猪的皮肤厚度存在显著差异，皮肤组织和皮肤FB来源的小细胞外囊泡样本经全转录组水平分析表现出基因表达上的差异变化。
那么皮肤细胞的异质性模式是否也存在于两个猪群中，进而导致皮肤厚度的差异呢？
首先，作者发现CH猪的平均真皮厚度为5.29mm，而LW猪的平均真皮厚度仅为2.61mm。对LW猪背部皮肤也进行单细胞测序，获得18,411个细胞，6种细胞类型。比较两个猪群的细胞图谱表明主要细胞类型一致：仍然是SMC、EC和FB；比较DEG结果发现FB基因表达显著差异。作者又分别对主要三种细胞的DEG进行GO、KEGG分析发现EC细胞的脂质代谢（LPCAT2 、 ENPP2 基因），ECM细胞的的PPAR信号通路，FB细胞的PI3K-AKT信号通路、蛋白质消化和吸收、ECM-受体相互作用等有显著差异，以上结果表明皮肤组织中的 ECM 积累可能取决于解剖区域或猪群之间的这些基因表达的不同。此外，CH猪背部皮肤FB存在一系列特异基因，如COL1A1、POSTN、TNN、INHBA、IGF1、COL11A1，而LW猪背部皮肤FB的特定基因有TM4SF1、CCL2和NGFR，说明FB具有品种转录组特性。
图6 不同解剖部位皮肤成纤维细胞（FBs）的异质性
6. 皮肤中不同细胞间胶原蛋白和层粘连蛋白代谢途径信号通讯信息交流丰富
为了研究皮肤组织中不同细胞间的交流，作者使用R包CellChat建立了皮肤细胞间的通信网络，分析得到36条信号通路。其中，COLLAGEN（胶原蛋白）和LAMININ（层粘蛋白）通路在细胞间表现出高度丰富的信号作用。作者分析了三种主要细胞的14个cluster中的胶原蛋白/层粘连蛋白通路：SMCs cluster 2、5、6和ECs cluster7可能通过COLLAGEN/LAMININ通路中的 COL1A1/LAMA2配体、ITGA1+ITGB1受体积极参与细胞通讯。此外，SCENIC算法证明NFKB1是三种细胞类型DEG之间的共同调节子，EGR1和ATF3调节子调节SMC和EC中的靶基因。
图7 皮肤中各种细胞类型之间的信号交流
科技君点睛
本研究绘制了猪皮肤较完整的单细胞转录组图谱，结合皮肤表型探究3种主要细胞SMCs、ECs、FBs在不同组织部位的细胞异质性；通过拟时分析，描绘了SMCs、ECs细胞动态分化轨迹；进一步比较了CH猪和LW猪背部皮肤单细胞水平上的基因表达及功能差异。最后，作者使用CellChat建立皮肤细胞间的通信网络，探究各种细胞之间的信号交流机制。
