2023-11-16
前言
在之前的软文中，我们已经对荧光定量PCR的原理、分类、流程、方法和实验结果给小伙伴们做了详细的介绍，但是荧光定量PCR技术具体有哪些应用呢？以及荧光定量PCR和高通量测序有着怎样密不可分的关联呢？今天我们将给小伙伴们一一揭晓！ 微生物样本高通量测序——绝对定量：从相对丰度到绝对丰度 微生物与人类的生活密不可分，在大自然的各个角落，都可以看到微生物的身影。微生物样本也是多种多样，包括环境微生物组：土壤、水体、污泥、空气等；肠道微生物组：胃黏膜、唾液、肺部灌洗液、分泌物、粪便，小鼠肠道，反刍动物瘤胃等；工业微生物组：传统发酵液、生物冶金或活性物质等。 对微生物样本进行高通量测序与生物信息学分析，可以了解样本中的各类微生物组成情况，掌握微生物的多样性分布，获取微生物样本中氮循环、碳循环、磷循环、硫循环等各类功能基因的组成与分布情况。解析样本中的物种组成和相对丰度信息，对微生态研究具有重要的促进作用。 然而我们需要注意一点，那就是相对丰度并不能反映样本中每种微生物的真实数量和组间样本的真实差异。由于技术限制,高通量测序结果只能反映样本中微生物及各类基因的分类及其相对丰度,不同分类水平微生物和基因的绝对丰度却不能获得。当样本间微生物总量变化较大时,以相对丰度表征不同样本间的微生物数量及基因含量的差异,可能会带来误差,甚至是相反的结论。 相比于相对丰度，绝对定量分析能反映样本中每种微生物甚至每类基因的真实数量和组间样本的真实差异，因此绝对定量分析更能反映样本微生物的真实变化，是微生态研究中不可或缺的环节。而荧光定量PCR是定量物种绝对丰度的金标准！ 例如：想知道取自不同地区的土壤样本中细菌、真菌、甲烷氧化菌的总含量差异，使用高通量测序技术便无法获取其真实数量与组间样本差异，这时候就需要使用荧光定量PCR——绝对定量技术了！ 通过使用细菌16S、真菌ITS、甲烷氧化菌pmoA的引物对样本总DNA进行扩增，在PCR反应体系中加入荧光化学物质，得到不同样本中对应PCR产物荧光信号达到阈值时所需要的循环数（Ct值）。利用已知拷贝数的标准品作出标准曲线，通过带入土壤样品中的16S、ITS、pmoA扩增产物的Ct值，即可根据标准曲线计算出土壤样品中16S、ITS、pmoA的基因拷贝数。 不同土壤样品中16S、ITS、pmoA的基因拷贝数，即为样品中对应基因的总含量，代表着细菌、真菌、甲烷氧化菌的绝对丰度，体现土壤样本中细菌、真菌、甲烷氧化菌的总含量水平与差异。 转录组测序——相对定量：对大规模差异表达基因筛选的实验验证 转录组测序(Transcriptome sequencing)是通过高通量测序技术快速全面地获得某一物种特定细胞或组织在某一状态下的几乎所有的转录本及基因序列并进行测序分析。通过转录组测序，可以帮助我们了解各种比较条件下所有基因的表达差异，而转录组的主要目的之一便是寻找基因表达的差异。 由于技术限制，转录组测序往往用于差异表达基因的大规模筛选，反应样本整体的基因表达变化趋势，但不能保证每一个基因的变化趋势都与实际情况保持一致。因此，对转录组测序分析筛选出的差异表达基因的实际表达差异进行实验验证就显得十分必要。 目前来说，荧光定量PCR技术是验证基因表达差异的金标准。Q-PCR验证是转录组测序分析下游必不可少的补充验证实验，是发文章所必须的。一般根据转录组测序的差异表达基因分析结果，验证15-20个差异基因比较合适。 荧光定量PCR技术通过在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，对PCR扩增反应中每一个循环产物的荧光信号进行实时检测，得到一条荧光扩增曲线图，以此对初始模板进行定量分析。相对定量技术往往用于转录组测序下游的基因差异表达验证。 相对定量是以待测样本的RNA反转录的cDNA为模版进行PCR扩增，通过设计靶序列的特异引物扩增靶序列的特异序列，根据靶序列相对于对照样本的量的变化，比较两个或多个不同处理的样本中的基因表达水平的高低变化，得到的结果是表达量差异的比率。在此过程中要选取一定的内参基因，以除去不同标本在RNA产量、质量以及反转录效率上可能存在的差别，进行校正和标准化。 转录组测序与荧光定量PCR本身就是两种不同的实验平台，两者不能一一对应。对于转录组测序分析的差异表达基因，一般是挑选大量的基因验证，两者的结果从统计学上来说存在较高的相关性（r2>0.8），视为验证成功。在文章中展示的荧光定量PCR结果往往是和转录组测序分析结果一致的差异表达基因，对于其他验证结果不好的、与预期结果不符或者不能阐述清楚与预期结果不符原因的基因则选择不在文章中呈现了。qPCR验证测序结果的吻合率通常为60~70%。 总 结 不论是对微生物样本高通量测序分析结果的数据扩充，将微生物多样性、宏基因组分析的相对丰度数据进一步补充绝对丰度数据，还是对转录组测序分析结果差异表达基因的验证，都离不开荧光定量PCR技术的下游补充与完善。正在做或者打算做微生物、转录组高通量测序的小伙伴们，千万不要忘记下游的荧光定量PCR实验哦！
