2023-11-22
前言
N6-methyladenosine(m6A)是真核生物中mRNA最普遍且丰富的内源性修饰，主要参与调控premRNA到成熟mRNA的过程，并且在细胞分化和重编程、应激反应、胚胎发生和肿瘤发生的过程中发挥重要作用。自m6A首次发表以来，已经开发了很多技术，例如基于抗体的PA-m6A-seq、miCLIP、m6A-CLIP以及不基于抗体的DART-seq、MAZTER-seq等技术。m6A通常需要大量的输入材料。迄今为止报道的最低起始量10ng的DART-seq，然而，DART-seq需要细胞中APOBEC1-YTH表达，以诱导m6A附近的C到U的脱氨作用，从而限制了其在培养细胞中的应用。尽管取得了这些进步，但仍需要高灵敏度且适用低RNA/细胞起始量的胞内m6A全转录组鉴定方法。
2023年6月，挪威奥斯陆大学的Arne Klungland课题组和密西根大学Kin Fai Au课题组联合在Nature Biotechnology发表研究论文：Single-cell m6A mapping in vivo using picoMeRIP-seq，开发了一种基于抗体的低RNA/细胞起始量的m6A鉴定技术picoMeRIP-seq，该方法可以用于全转录组水平鉴定100pg PolyA RNA、单个斑马鱼、单个小鼠卵子和早期胚胎以及胚胎干细胞的m6A图谱鉴定。该方法蛀牙对一些关键步骤进行优化：(1)细胞裂解方法以及采用一步管方法去除gDNA和rRNA；(2)通过超声处理进行RNA片段化；(3)选择具有较好特异性的商业m6A抗体；(4)抗体结合后RNA洗涤条件优化：提高表面活性剂和盐浓度去除非特异结合材料。如图1(a)所示。首先从RNA投入量、重复性、关键分析参数、特异性水平和背景对picoMeRIP-seq的重复及定量性能、可靠性等进行评估。如图1(c、d、e)所示。其次将picoMeRIP-seq应用于单个斑马鱼受精卵进行原理验证单细胞m6A分析的可行性。如图1(f、g)所示。根据评估结果支持了picoMeRIP-seq对m6A鉴定具有高特异性和实用性。最后为了进一步证明该方法的多功能性，将picoMeRIP-seq应用于荧光激活细胞分选的mES细胞，实验结果具有良好的重复性和非常好的m6A峰，但没有获得足够的文库进行测序，后续可以尝试进一步优化。 图1 最终对picoMeRIP-seq进行基准测试，将该方法应用到单个小鼠受精卵和着床前胚胎(双细胞，八细胞和囊胚阶段的单小鼠生发囊泡阶段卵母细胞)，中期I期阶段卵母细胞和单个胚胎的全程的转录组m6A修饰图谱的检测。PCA分析显示受精卵到胚胎的各个阶段的m6A修饰可以将各个发育时期很好的区分。根据m6A修饰的基序分析，发现m6A主要定位在翻译终止子附近，并且显著富集经典的m6A序列RRACH(R=G/A，H=A/C/U)，这与作者之前的研究结果相一致，表明m6A标记的MERVL转录本在ZGA中的潜在调节作用。如图2所示。 图2 综上所述，目前已经开发并基准化一种用于低RNA/细胞起始量的胞内m6A修饰图谱鉴定的技术-picoMeRIP-seq，该技术的实验灵敏度允许单卵母细胞和单胚胎细胞研究，从而开启人类卵母细胞和植入前胚胎生育力与发育缺陷的相关性研究的新时代。
