2023-11-23
单细胞测序技术是指获取单个细胞遗传信息的测序技术，即在单个细胞水平上，对基因组或转录组进行提取扩增和高通量测序分析，是探究细胞异质性的利器。斑马鱼作为研究器官发育或免疫调控的重要模式动物，是目前单细胞研究最多的水产生物，其单细胞研究也为其它水产生物奠定了基础。今天我们就对近期发表的《Cell Reports》文章进行解析，看单细胞测序技术如何解析成年斑马鱼不同器官中巨噬细胞和树突状细胞的异质性。
1、研究背景 组织驻留巨噬细胞(TRM)和树突状细胞(DC)是天然免疫系统的重要组成部分，在免疫、组织发育、组织动态平衡和组织修复等方面发挥着关键作用。此外，巨噬细胞和树突状细胞在组成上也呈现出高度异质性。近年来，随着单细胞组学技术的发展，各种组织和器官中均被鉴定出了不同类型的巨噬细胞和树突状细胞亚群。然而，目前对于这些不同组织和器官中的亚群细胞在发育和功能上的关系仍然知之甚少。由于其保守的造血系统以及各种遗传工具和命运图谱策略的可利用性，斑马鱼成为研究造血细胞（包括TRM和DC）发育的最佳模型系统。尽管斑马鱼巨噬细胞已经被广泛地研究了各种报告系和缺陷系，然而，斑马鱼的TRM异质性和DC细胞的生物学特性在很大程度上仍不清楚。本研究利用单细胞转录组测序破译成年斑马鱼中TRM和DC细胞的异质性，为进一步研究这些细胞的发育和功能特性提供了有价值的工具。
2、研究思路
3、研究结果 一、成年斑马鱼mpeg1.1+免疫细胞图谱 为了系统性评估成年斑马鱼TRM和DC的异质性，本研究利用标记泛髓系细胞的转基因斑马鱼品系Tg (mpeg1.1:DsRedx)，通过流式细胞分选富集了6个不同器官（3个屏障组织（表皮、鳃、肠）和3个内脏器官（肝、心脏和脑））中的mpeg1.1+细胞进行了单细胞转录组测序（图1A）。分别对源于表皮：2,832鳃：3,711，肠：3,286；肝：3,248；心脏：3,679脑：2,842个高质量单细胞进行聚类分析，共注释出8个细胞亚型（图1B、1C）。本研究发现在所有的器官中均注释出巨噬细胞和DC（图1D）。 图1 实验设计和成年斑马鱼mpeg1.1+免疫细胞图谱展示 二、mpeg1.1+免疫细胞群在各个器官中高度保守 接下来，本研究通过结合来自所有器官的mpeg1.1+细胞群进行比较分析，评估来自不同器官中相同细胞群体的转录模式的相似性。Pearson相关分析显示，来自不同器官的相同细胞群通常高度相关（图2A），结果表明每个细胞群体都有一个核心转录组特征，该特征定义了其身份并赋予了跨器官的特殊功能。为了确定不同细胞群体的核心转录组特征，本研究针对所有器官的细胞亚型进行了亚型间差异表达基因（DEG）分析，发现巨噬细胞上调与吞噬作用相关的基因，如fcer1gl，scarb2a, lgals3bpa等。此外，所有器官中的巨噬细胞和DC细胞显示出保守的谱系特异性转录因子(Tf)的表达，如巨噬细胞中的cebpa和mafbb，以及DC中的id2a和znf366（图2C）。它们是经过前期研究对巨噬细胞和DC细胞跨物种发育至关重要的调控因子。综上所述，本研究定义了斑马鱼器官中不同mpeg1.1+免疫细胞群的核心转录组特征，并揭示了可能参与其发育的谱系特异性转录因子。 图2 mpeg1.1+免疫细胞群跨器官特征分析 三、在屏障组织、肝脏和心脏中存在两个功能不同的巨噬细胞亚群 为了进一步表征巨噬细胞的异质性，本研究提取了所有器官的巨噬细胞，并以更高的分辨率重新进行降维聚类，注释出lgals3bpb+巨噬细胞和ccl34a4+巨噬细胞，它们在屏障组织、肝脏和心脏中具有不同的分布模式，与lgals3bpb+巨噬细胞不同，ccl34a4+巨噬细胞分别是肝脏中的主要巨噬细胞群和心脏中唯一的巨噬细胞群（图3A、3B、3C）。亚型间差异表达基因（DEG）分析发现Lgals3bpb+巨噬细胞高水平表达与吞噬作用相关的基因，如lgas 13bpa等，表明其强大的吞噬功能。此外，Lgals3bpb+巨噬细胞高表达炎性趋化因子，如cxcl8a等，表明其具有促炎能力。这些数据表明，lgals3bpb+巨噬细胞具有较强的吞噬和免疫细胞募集能力，具有促炎作用。因此，本研究将lgals3bpb+巨噬细胞群定义为促炎巨噬细胞（pro-inflammatory macrophages）。另一方面，ccl34a4+巨噬细胞最显著的特征是它们广泛表达与组织重塑和再生有关的基因，如timp2b等。ccl34a4+巨噬细胞可能在正常器官发育和组织内稳态维持中发挥关键作用，故本研究将ccl34a4+巨噬细胞命名为促重塑巨噬细胞（pro-remodeling macrophages）（图3D、3E、3F）。为了探索这两个巨噬细胞亚群之间的谱系关系，本研究分析了两个MP亚群在不同器官中转录因子的差异表达水平，结果发现这两个群体差异表达了许多与巨噬细胞发育和功能特化相关的转录因子（图3G）。综上，这两个功能不同的巨噬细胞亚群可能经历了不同的发育途径，受到不同的遗传程序的调节。 图3 跨器官的两个不同功能的MP亚群的鉴定 四、斑马鱼体内cDCs和pDCs的存在 为了进一步表征树突细胞的异质性，本研究提取了所有器官的树突细胞，并以更高的分辨率重新进行降维聚类，注释出cDCs细胞和pDCs细胞，在屏障组织、肝脏和心脏中，检测到一个主要的cDC亚群，斑马鱼cDCs高表达ccl35(包括ccl35.1和ccl35.2)和核受体4a2b(Nr4a2b)基因，这些发现表明，斑马鱼cDCs可能作为抗原呈递细胞发挥作用，并可能发挥重要的免疫调节作用。另一方面，斑马鱼pDCs明显表达高水平的组织蛋白BB(Ctsbb)和嘌呤能受体p2x3a(P2rx3a)基因，表明它们在抗病毒应答中的专门作用（图4A、4B、4C和4D）,综上所述，这些结果表明斑马鱼在成体器官中拥有功能保守的cDCs和pDCs，它们构成了有效的免疫系统来应对各种病原体的入侵。 图4 屏障组织、肝脏和心脏中cDCs和pDCs的鉴定 五、吞噬性小胶质细胞和调节性DCs存在于成年斑马鱼大脑中 本研究在成年斑马鱼大脑中鉴定了巨噬细胞、小胶质细胞和不同DC细胞群，包括cDCs和pDCs（图5A）。作为大脑驻留的巨噬细胞，小胶质细胞在调节中枢神经系统（CNS）的发育和功能方面起着至关重要的作用，基因表达分析发现其特异性表达小鼠和人类小胶质细胞的标记基因，如p2ry12、apoeb、apoc1、sall3a和sall3b（图5B），表明斑马鱼小胶质细胞具有进化保守的转录谱。与只有一个cDCs群的屏障组织、肝脏和心脏不同，大脑具有两个不同的转录cDC亚群，cnn3a+cDCs和ccl35+cDCs（图5C和5D），跨器官分析发现脑内ccl35+cDC亚群更像在其他五个器官中鉴定的常见ccl35+cDCs（图5E）。与MHCII类相关基因表达较高的ccl35+cDCs相比，脑特异性cnn3a+cDCs表达哺乳动物cDC1标记基因，如xcr1a.1、hepaca2和batf3（图5F），这表明其与ccl35+cDCs存在潜在的功能和谱系差异。综上，本研究在斑马鱼脑中发现着一类组织特异的cDC细胞亚群，其高表达了与免疫调节和神经保护相关的基因，预示了这些细胞在中枢神经系统发育和免疫稳态维持中具有重要作用。 图5 斑马鱼大脑中吞噬性小胶质细胞和调节性DCs的特性
4、研究总结 本研究系统性地解析了成年斑马鱼不同器官中巨噬细胞和树突状细胞的异质性，且基于这些不同巨噬细胞和树突状细胞亚群的标志基因，建立了多个特异性转基因报告鱼品系，为深入研究这些细胞亚群的发育和功能提供了有价值的工具和资源。
